论文摘要
霍乱弧茵既是自然水生环境中的土著性细菌也是引起人类腹泻疾病-霍乱的病原体。在自然环境中霍乱弧菌常常以生物膜的形式附着于生物体或者非生物体表面。生物膜是指附着于物质表面由细菌胞外多糖基质包裹的微生物群体,生物膜形态被认为是霍乱弧菌能在自然环境中长期存活的重要原因并与霍乱的季节性爆发有关。当霍乱弧茵进入人体以后,通过调控一系列体内特异性诱导表达基因来适应宿主体内环境实现成功感染。基于抗生素抗性的体内表达技术是一种用于筛选病原菌同宿主相互作用过程中体内特异性诱导表达基因的方法。本实验利用一种基于kan-rpsL抗性标签的体内表达技术筛选筛选了霍乱弧菌在感染成年小鼠过程中特异性诱导表达基因。首先通过转座子随机突变法建立了染色体上含无启动子的kan-rpsL抗性标签的突变子文库,文库细胞先通过体外高浓度链霉素筛选去除组成型表达菌株,然后经两轮体内体外筛选验证,获得体内卡那霉素抗性体外链霉素抗性/卡那霉素敏感的突变株就是转座子插入位点上游含体内诱导启动子的突变株。利用这种筛选策略共筛选到了5个含体内诱导基因的突变株,对突变株转座子插入位点序列的分析确定了4个霍乱弧菌感染成年小鼠过程中特异性诱导表达基因。其中一个基因VC0303编码一种组氨酸激酶感受蛋白,这种蛋白分子通常与另外一种调节蛋白构成双组分系统调节细菌许多重要的生理功能。另外确定的3个基因与氨基酸及核酸代谢相关,这类基因在以往的体内表达技术筛选中通常是占筛选到的体内表达基因中最多的一部分,表明这类代谢相关基因在霍乱弧茵感染过程中发挥重要作用。我们的研究结果表明,为了在小鼠体内生存及增殖,霍乱弧菌必需调节与感受和代谢相关的基因。同时通过对编码组氨酸激酶的VC0303基因的监测表明,该基因在LB和霍乱毒素诱导培养基AKI中均不能被诱导表达。为了鉴定霍乱弧菌在人造海水中生物膜形成相关基因,采用转座子随机突变法在聚苯乙烯96孔板中筛选了相关基因。总共获得了10株生物膜增加突变株,对转座子插入位点的序列分析确定了9个生物膜相关基因。其中rfbU基因编码一种甘露酰转移酶,该基因和其下游基因,rfbV是形成霍乱弧菌O抗原所必需的。对rfbU突变株的生物膜形成情况检测发现,该突变株在海水中能够形成比野生型菌株更厚的生物膜,同时对该突变株在LB和海水中细菌脂多糖（LPS）的检测发现突变株都不能产生LPS,表明LPS抑制霍乱弧菌海水中生物膜的形成。另外通过突变以及染色体上组成型表达另一个突变株转座子插入位点下游磷酸戊糖途径（PPP）相关基因的研究发现,PPP途径相关基因是霍乱弧菌海水中形成增厚生物膜所必需的。所有这些发现将为进一步深入研究霍乱弧菌海水中生物膜的形成提供科学依据。
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