3-羟基丙酸生物合成及辅因子代谢调控

论文摘要

3-羟基丙酸（3-HP）是一种重要的平台化合物,其产量直接影响着许多高附加值化学品的生产。本文以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）作为宿主,是因为它具有天然的甘油歧化途径,完整的dha调节酶系,并且可耐受高浓度甘油。通过代谢途径的优化,构建了兼具甘油合成及3-羟基丙酸合成的重组菌,既改善了菌体代谢过程中的辅酶平衡,又实现了3-羟基丙酸的高产。本文克隆了酿酒酵母甘油合成的关键酶基因：3-磷酸甘油脱氢酶（GPD1）和3-磷酸甘油酯酶（GPP2）,然后构建了两个基因串联共表达盒,在大肠杆菌内构建了一条以葡萄糖为底物生物甘油的途径,经SDS-PAGE验证,两基因均成功表达,摇瓶发酵的甘油产量为1.0g/l。渗透压实验表明该重组大肠杆菌比原始菌应对环境渗透压变化的适应能力明显增强。为了增加可溶性蛋白的表达量及省却诱导剂IPTG,在K. pneumoniae基因组中寻找组成型启动子,用于表达外源基因。克隆了甘油脱水酶的启动子区域,将质粒pET-28a的T7启动子替换为该启动子,构建了一个可在K. pneumoniae体内表达的载体,并将甘油合成途径的表达盒G12与该载体连接,该途径可在宿主K. pneumoniae中表达,SDS-PAGE分析表明,外源基因正确表达。通过对甘油在K. pneumoniae厌氧发酵代谢途经分析认为,要实现3-羟基丙酸的高产,需要对代谢途径进行优化,实现还原力的平衡,因此将甘油合成途径作为一个NAD再生系统引入3-羟基丙酸合成途径,构建了一个包含：3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油酯酶、醛脱氢酶、甘油脱水酶基因的表达载体。这四个基因受控于两个组成型启动子的串联共表达,增加了酶催化的空间邻近效应,有助于提高该途径的催化效率。经过SDS-PAGE及初步表达鉴定,该载体可在K. pneumoniae内表达这四个基因,打通了葡萄糖到3-羟基丙酸的代谢途径,以葡萄糖为底物发酵10h时3-羟基丙酸产量达到最大值0.52g/l。为了提高3-羟基丙酸的产量,对构建的重组K. pneumoniae KGAB进行微氧发酵,通过对比原始K. pneumoniae及未引入NAD再生途径的3-羟基丙酸生产菌KAB,研究辅酶平衡系统的引入对于生产的影响。发酵结果表明,代谢途径的优化确实有助于产量的提高,KGAB的3-羟基丙酸产量达6.6g/l,比KAB提高了317%,甘油转化率0.75 mol·mol-1 glycerol,比KAB提高了200%,生产强度0.82（g·L-1·OD-1 cell·h-1）,提高了6倍。同时研究了添加葡萄糖对重组菌发酵特性的影响。在发酵培养基的基础上添加2g/l,5g/l,0g/l,20g/l葡萄糖,进行微氧发酵。对于生物量的积累,20g/l葡萄糖的浓度是最优的,在发酵前期,甘油消耗速率在5g/l和20g/l浓度下高于其它浓度。通过分析添加不同葡萄糖浓度对于产量的影响,发现发酵初期时,3-HP产量与添加葡萄糖的浓度成正比,再结合生物量,发现主要是由于葡萄糖浓度大的菌生长快,生物量积累多的原因,在对单位细胞3-HP产量进行分析,发现生物量的积累确实对总产量的提高有贡献。就单位细胞产量而言,添加Og/l,10g/l,20g/l葡萄糖在发酵初期有利于3-羟基丙酸的产生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 甘油途径
• 1.1.1 甘油的生理学意义
• 1.1.2 酵母渗透压应答机制及甘油合成途径
• 1.1.3 甘油作为重要的平台化合物
• 1.2 生物鲁棒性
• 1.3 3-羟基丙酸概况
• 1.3.1 3-羟基丙酸理化性质与用途
• 1.3.2 3-羟基丙酸的生产方法
• 1.3.3 利用微生物发酵生产3-羟基丙酸
• 1.3.4 生产菌种
• 1.4 3-羟基丙酸代谢途径的辅酶平衡
• 1.5 本课题的立项意义
• 第二章 产甘油重组大肠杆菌构建及耐高渗透压性能测定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酿酒酵母S. cerevisiae基因组DNA的提取
• 2.3.2 培养条件
• 2.3.3 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因GPD1和GPP2
• 2.3.4 载体模块pET-GPD1和pET-GPP2的构建
• 2.3.5 质粒pET-GPD1和pET-GPP2的鉴定
• 2.3.6 表达载体pET-G12的构建
• 2.3.7 序列测定与分析
• 2.3.8 重组质粒pET-G12化学转化法转化E.coli.BL-21
• 2.3.9 重组质粒pET-G12在E.coli BL-21中的表达
• 2.3.10 甘油途径对重组大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响
• 2.3.11 发酵参数分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 S. cerevisiae基因组DNA的提取
• 2.4.2 聚合酶链式反应扩增基因GPD1和GPP2
• 2.4.3 载体模块pET-GPD1和pET-GPP2的构建
• 2.4.4 表达载体pET-G12的构建
• 2.4.5 GPD1-GPP2基因的序列测定与分析
• 2.4.6 重组菌E.coli BG12中3-磷酸甘油脱氢酶及3-磷酸甘油酯酶的表达
• 2.4.7 重组菌产甘油发酵
• 2.4.8 大肠杆菌高渗溶液耐受浓度
• 2.4.9 甘油的途径的表达对重组菌渗透压耐受能力的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 甘油途径在肺炎克雷伯杆菌中的表达研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株、质粒
• 3.2.2 试剂与仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 K. pneumoniae基因组的提取
• 3.3.2 K. pneumoniae组成型启动了的扩增
• 3.3.3 Pk启动子与质粒pET-28a的连接、转化
• 3.3.4 表达载体pKP-G12的构建
• 3.3.5 K. pneumoniae感受态细胞的制备及电转化
• 3.3.6 重组菌KG12在表达K. pneumoniae中的表达
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 K. pneumoniae基因组的提取
• 3.4.2 K. pneumoniae组成型启动子Pk的扩增
• 3.4.3 质粒pET-28a的提取
• 3.4.4 阳性克隆鉴定
• 3.4.5 质粒pET-kp提取
• 3.4.6 PG12为模板扩增G12表达盒
• 3.4.7 阳性克隆鉴定
• 3.4.8 3-磷酸甘油脱氢酶及3-磷酸甘油酯酶的在K. pneumoniae中表达
• 3.5 本章小结
• 第四章 在K.pneumoniae中构建辅酶平衡系统
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株、质粒
• 4.2.2 试剂与仪器
• 4.2.3 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 表达盒Pk-ald4-dhaB的扩增
• 4.3.2 GPD1,GPP2, ald4与dhaB基因串联共表达质粒的构建
• 4.3.3 重组质粒pKGAB电击法转化K. pneumoniae
• 4.3.4 3-磷酸甘油脱氢酶GPD1,3-磷酸甘油酯酶GPP2,醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB在K. pneumoniae中的表达
• 4.3.5 重组菌的发酵培养
• 4.3.6 高效液相色谱（HPLC）检测代谢产物的浓度
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 质粒pKP-AB的提取与表达盒kp-ald4-dhaB的扩增
• 4.4.2 转化产物的鉴定
• 4.4.4 重组菌的表达
• 4.5 本章小结
• 第五章 重组菌产3-羟基丙酸研究及NAD再生系统引入对生产的影响
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 菌株、质粒
• 5.2.2 试剂与仪器
• 5.2.3 培养基
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 重组菌的发酵培养
• 5.3.2 生物量的测定
• 5.3.3 产物的检测
• 5.3.4 底物的检测
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 引入NAD对于重组菌发酵参数的影响
• 5.4.2 发酵参数
• 5.4.3 有机酸的产量
• 5.4.4 添加葡萄糖对发酵产3-hp的影响
• 5.5 本章小结
• 第六章 实验总结与建议
• 6.1 主要结论
• 6.2 本论文的创新点
• 6.3 问题与建议
• 参考文献
• 附录1 试剂
• 附录2 仪器设备
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介