论文摘要
敬钊缨毛蛛是在我国海南岛发现的一种有毒蜘蛛。它的毒液由许多具有不同生物活性物质组成。为了更好地开发利用该生物资源,阐明敬钊缨毛蛛毒素分子多样性及其遗传进化机制是非常重要的。我们取敬钊缨毛蛛的毒腺建立cDNA文库,随机挑取单克隆进行测序,得到788个高质量的表达序列标签。这些表达序列标签去冗余后,得到356个唯一序列,其中包括271个单拷贝序列和85个多拷贝重叠序列。这些唯一序列的31.4%是编码分泌蛋白的,其中29.1%是富含半胱氨酸的多肽,此类多肽称之为胱氨酸结毒素（CKTs）,以及2.3%的其他分泌蛋白序列;54.0%是与普通细胞蛋白相关的;还有14.6%的序列没找到相似的已知序列。所有鉴定到的序列提交GenBank,序列接入号为:EU233831-EU233934和FE530957-FE531203。蜘蛛粗毒中的胱氨酸结毒素是作用于各种离子通道的新型配体。对104个胱氨酸结毒素前体进行系统进化分析显示,这些毒素可以分为6个家族,以及19个低相似性序列构成的“孤儿”家族。为了进一步研究这些毒素家族的结构、功能和进化关系,我们分离纯化到10个分别来自各家族的毒素,对其进行电生理功能检测、结构建模比较、进化分析和丰度分析。实验结果显示这些毒素家族分属两种类型:孔道堵塞毒素和门控调制毒素。孔道堵塞毒素在粗毒中的含量比较多,在蜘蛛中分布较广。孔道堵塞的毒素作用靶点专一,而所作用的靶点在生物进化中也较保守。因此,这类毒素是进化中比较保守、产生比较早的一类。门控调制毒素所包含的分子种类很多,这是与通道多样化的调制位点共进化的结果。对这些多肽毒素系统研究有可能为深入的药理学应用和研究提供大量的分子模板。另一方面,对普通细胞蛋白相关的转录子进行的基因注释揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要细胞生理过程的相关成分,比如蛋白翻译后修饰,细胞运动,蛋白质合成,能量供应等等。敬钊缨毛蛛毒腺的转录组分析和基因的注释编目展示了毒腺这个特化的产毒器官中的生理概况。敬钊毒素—Ⅲ（JZTX-Ⅲ）是来自于敬钊缨毛蛛的一个通过电压门控调制来抑制心肌钠通道的毒素。与β-蝎毒素不同的是,它使通道激活电压朝去极化方向漂移约10 mV,推测其结合位点可能为位点4。JZTX-Ⅲ展示了其对电压门控心肌钠通道亚型高亲和力和高选择性,使之有希望成为研究心肌钠通道的有力工具。然而,该分子与钠离子通道作用的活性表面还不得而知。为此,本课题中我们成功表达了JZTX-Ⅲ,表达的毒素与天然的毒素在分子、构型和生理学活性上都一致。于是,对其进行丙氨酸扫描,继续表达JZTX-Ⅲ的20个单残基由丙氨酸取代的突变体。其中一个突变体未能表达成功。用膜片钳实验一一检测突变体在表达于HEK293细胞上的Nav1.5对电流的作用。实验表明,13个突变体对抑制Nav1.5电流的浓度依赖性的改变很小,有6个突变体对此影响较大,有一个甚至无法检测到活性。突变体实验证明其活性表面是由疏水氨基酸和酸性氨基酸组成,而碱性氨基酸的突变对毒素抑制Nav1.5通道电流的活性影响不大。而且,当13位的精氨酸突变为谷氨酸时,其抑制Nav1.5的IC50值为31.9nM,其活性是野生型JZTX-Ⅲ的十倍。在JZTX-Ⅲ的三维结构图上描出这些关键残基,疏水性残基在一个面上形成一个疏水面,两个酸性残基处于N端,在疏水面的相对面。从以上结果确定了JZTX-Ⅲ这个门控调制毒素专一作用于Nav1.5的分子活性表面,提示JZTX-Ⅲ在与心肌钠通道结合时采取的是一种被称为Voltage Sensor Trapping的模式,利用其疏水面结合于心肌钠通道DomainⅡ区域,而其另一面的带电荷残基,特别是Asp1和Glu3利用电性引力捕获钠通道的富含碱性氨基酸残基的电压敏感区域即S4片段,从而影响钠通道的开放。
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相关论文文献
- [1].Lys4突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响[J]. 生命科学研究 2008(01)
- [2].Arg20突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响[J]. 生物工程学报 2008(07)
- [3].一种新型人血小板聚集抑制剂的纯化与初步活性鉴定[J]. 湖南中医药大学学报 2008(01)
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