猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究

论文题目: 猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 黄红亮

导师: 陈焕春,熊远著

关键词: 猪传染性胸膜肺炎,胸膜肺炎放线杆菌,外毒素,外毒素,外毒素,外毒素,单克隆抗体

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。该病给集约化养殖业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,目前已分离鉴定了15种血清型的APP,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已证实了ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxⅢ被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxⅣ仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验(IHA),该方法具有血清型特异性,不适合于对APP的普查。最近发现的ApxⅣ存在于所有血清型APP中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。ApxⅣ的另一特点为体内诱导的毒素,而目前市面上用体外培养方法制备的疫苗中均不存在ApxⅣ,因此基于ApxⅣ的诊断方法可以鉴别诊断自然感染猪与疫苗免疫猪。为了建立有效的诊断方法及对APP外毒素作用机制进行深入研究提供特异性单克隆抗体,我们开展了以下工作: 1 apxⅣ基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达 依据APP血清1型的apxⅣ基因序列(GeneBank登陆号:AF021919)合成特异性引物,分三段从APP 0306SYML中分别扩增了apxⅣ基因的5′-端3.6Kb、5′-端2.5Kb和3′-端3.0Kb片断,分别克隆到pMD-18T,获得重组质粒pT apxⅣ3.6、pT apxⅣA5与pT apxⅣA3,并进行了测序:将apxⅣA5与apxⅣA3分别克隆到质粒pET-28b的T7启动子下游,构建了重组原核表达质粒pET apxⅣA5与pET apxⅣA3,分别用于表达ApxⅣ N-端与C-端蛋白,转化E. coli BL21(DE3)后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量分别为90kDa与115kDa,分别命名为rApxⅣAN与rApxⅣAC,表达产物主要以包涵体形式存在,Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。 2 鉴别诊断方法的建立 用大肠杆菌表达的重组蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为2.97μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:80。通过检测53份猪传染性胸膜肺炎阴性血清,确定该方法的临界值为0.336。该方法的重复性良好。用该方法从副猪嗜血杆菌(HPS)、产毒素巴氏杆菌(DNT~+Pm)、大肠杆菌(E. coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪衣原体(CP)的标准阳性血清及APP全菌灭活苗与类毒素菌苗免疫猪血清中检测不到ApxⅣ抗体,而从APP活菌感染的动物血清中能检测到ApxⅣ抗体,说明该方法不仅具有种特异性,只能用于APP感染的检测,还可以鉴别诊断全菌灭活疫苗或亚

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词

第1章 文献综述

1.1 猪传染性胸膜肺炎的病原学

1.1.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现

1.1.2 胸膜肺炎放线杆菌的特征

1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力

1.1.3.1 荚膜

1.1.3.2 脂多糖

1.1.3.3 外膜蛋白

1.1.3.4 溶血外毒素

1.1.3.5 转铁结合蛋白

1.1.3.6 酶类

1.1.3.7 菌毛和鞭毛

1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学及危害

1.2.1 猪传染性胸膜肺炎的发生和传播

1.2.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状

1.2.3 猪传染性胸膜肺炎的危害

1.3 猪传染性胸膜肺炎的临床症状

1.4 猪传染性胸膜肺炎的病理学

1.4.1 猪传染性胸膜肺炎的病理变化

1.4.2 猪传染性胸膜肺炎致病机理

1.5 猪传染性胸膜肺炎的诊断

1.5.1 细菌分离鉴定

1.5.2 补体结合试验

1.5.3 酶联免疫吸附试验

1.5.4 凝集试验

1.5.5 间接血凝试验

1.5.6 间接荧光抗体试验

1.5.7 乳胶凝集试验

1.5.8 免疫扩散试验

1.5.9 沉淀试验

1.5.10 聚合酶链式反应

1.6 猪传染性胸膜肺炎的免疫预防

1.6.1 全细菌灭活疫苗

1.6.2 亚单位疫苗

1.6.3 弱毒疫苗

1.6.4 ghosts疫苗

1.6.5 口服疫苗

第2章 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ基因的克隆、测序及表达

2.1 研究目的和意义

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.1.1 质粒及菌株

2.2.1.2 主要药品及试剂

2.2.1.3 抗生素的配制

2.2.1.4 细菌培养基的配制

2.2.1.5 质粒抽提与鉴定试剂的配制

2.2.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制

2.2.1.7 Western blot缓冲液的配制

2.2.1.8 其它试剂的配制

2.2.1.9 本研究中所用的寡核苷酸引物

2.2.2 方法

2.2.2.1 细菌的增殖及基因组的提取

2.2.2.2 apxⅣ3.6片段的扩增

2.2.2.3 apxⅣA5、apxⅣA3片段的扩增

2.2.2.4 PCR产物的回收与纯化

2.2.2.5 PCR产物的克隆与测序

2.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制各(氯化钙法)

2.2.2.7 连接产物及质粒的转化

2.2.2.8 质粒的提取

2.2.2.9 重组质粒的酶切鉴定

2.2.2.10 重组表达质粒pETapxⅣA5和pETapxⅣA3的构建

2.2.2.11 诱导表达

2.2.2.12 SDS-PAGE电泳

2.2.2.13 Western blot

2.2.2.14 APP感染小鼠血清的制备

2.3 结果与分析

2.3.1 apxⅣ3.6、apxⅣA5与apxⅣA3的克隆与测序

2.3.2 pETapxⅣA5与pETapxⅣA3表达载体的构建

2.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析

2.3.4 表达产物的Western-blot检测

2.4 讨论

2.4.1 apxⅣ基因的克隆与表达

2.4.2 ApxⅣ的作用

2.4.3 ApxⅣ的应用

2.5 小结

第3章 猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法研究

3.1 研究目的和意义

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.1.1 主要试剂及材料

3.2.1.2 血清

3.2.1.3 包涵体提取用缓冲液的配制

3.2.1.4 ELISA及IHA缓冲液的配制

3.2.2 方法

3.2.2.1 包涵体提取

3.2.2.2 不可溶性表达产物(包涵体)的溶解和复性

3.2.2.3 猪胸膜肺炎疫苗免疫血清的制备

3.2.2.4 ApxⅣ-ELISA操作程序

3.2.2.5 ApxⅣ-ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度的选择

3.2.2.6 ApxⅣ-ELISA判断标准的确定

3.2.2.7 ApxⅣ-ELISA重复性检测

3.2.2.8 ApxⅣ-ELISA分析特异性检测

3.2.2.9 ApxⅣ-ELISA与间接血凝试验(IHA)对比试验

3.2.2.10 包被抗原保存期的测定

3.3 结果与分析

3.3.1 rApxⅣAN抗原最佳包被量和血清最佳稀释度的确定

3.3.2 ApxⅣ-ELISA判断标准

3.3.3 ApxⅣ-ELISA重复性

3.3.4 ApxⅣ-ELISA分析特异性

3.3.5 ApxⅣ-ELISA与IHA对比试验

3.3.6 疫苗免疫动物和活菌感染动物中Apx毒素抗体的检测

3.3.7 包被抗原保存期的测定

3.3.8 猪传染性胸膜肺炎的血清学调查

3.4 讨论

3.4.1 细菌裂解

3.4.2 包涵体的溶解及复性

3.4.3 ApxⅣ-ELISA非特异性的消除

3.4.4 ApxⅣ-ELISA的种特异性

3.4.5 猪传染性胸膜肺炎的鉴别诊断

3.4.6 ApxⅣ-ELISA的临床应用

3.5 小结

第4章 胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究

4.1 研究目的意义

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.1.1 细胞、菌株、载体、动物

4.2.1.2 培养基及主要试剂

4.2.1.3 培养基及主要试剂的配制

4.2.2 方法

4.2.2.1 单克隆抗体制备的技术路线

4.2.2.2 抗原的制备

4.2.2.3 动物免疫

4.2.2.4 SP2／O骨髓瘤细胞的活化

4.2.2.5 SP2／O骨髓瘤细胞的制备

4.2.2.6 免疫脾细胞的制备

4.2.2.7 饲养细胞的制备

4.2.2.8 细胞融合

4.2.2.9 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清

4.2.2.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)

4.2.2.11 杂交瘤细胞染色体数的检测

4.2.2.12 单克隆抗体的生产和效价测定

4.2.2.13 单克隆抗体亚类鉴定

4.2.2.14 单克隆抗体的结合活性及特异性鉴定

4.2.2.15 单克隆抗体识别表位分析

4.3 结果与分析

4.3.1 抗原的制备

4.3.2 细胞融合

4.3.3 杂交瘤细胞的筛选

4.3.4 单克隆抗体的生产和效价测定

4.3.5 杂交瘤细胞染色体数的检测

4.3.6 单克隆抗体亚类鉴定

4.3.7 ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的结合活性与特异性

4.3.8 ApxⅣ单克隆抗体的特异性

4.3.9 单克隆抗体识别表位分析

4.4 讨论

4.4.1 免疫用抗原

4.4.2 动物的免疫

4.4.3 细胞融合

4.4.4 杂交瘤细胞的筛选

4.4.5 杂交瘤细胞的克隆

4.4.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏

4.4.7 污染和控制

4.4.8 ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的结合活性与特异性

4.4.9 ApxⅣ单克隆抗体的特异性

4.4.10 ApxⅣ单克隆抗体识别表位分析

4.5 小结

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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• [4].己烯雌酚残留免疫学快速检测研究[D]. 杨兴东.四川农业大学2015
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相关论文

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