论文摘要
目的:探讨重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）肺损伤（acute lung injury,ALI）时肺表面活性蛋白A（surfactant protein A,SP-A）、分泌型磷脂酶A2-Ⅱ（secreted phospholipase A2,sPLA2-Ⅱ）的表达,及其在ALI发病中的作用,同时观察肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡcells,ATⅡ）在急性胰腺炎肺损伤时的形态及功能改变,并观察清胰汤对SP-A、sPLA2-Ⅱ表达及病情转归的影响。急性重症胰腺炎时增高的sPLA2-Ⅱ对ATⅡ细胞损伤作用是引起急性胰腺炎肺损伤的重要因素,急性胰腺炎相关性腹水中sPLA2含量明显增高。本研究进一步行ATⅡ细胞原代培养,用大鼠SAP模型腹水干预细胞,观察细胞增殖状况和生存率改变;并分别应用sPLA2-Ⅱ抑制剂（KH064）、Emodin干预,观察其对腹水预处理ATⅡ细胞增殖、SP-A表达的影响,及对细胞形态功能的影响。进一步揭示SP-A、sPLA2Ⅱ及ATⅡ细胞在急性胰腺炎肺损伤发病中的作用,为临床治疗急性肺损伤寻求更为合适的药物作用靶点。方法:实验一:采用胆胰管内逆行注入1.5%去氧胆酸钠建立大鼠SAP时ALI模型。将SD大鼠随机分为假手术组（SO组,n=10）、模型组（SAP组,n=10）、清胰汤组（QYT组,n=10）、地塞米松组（DEX组,n=10）、善宁组（SS组,n=10）和分泌型磷脂酶A2-Ⅱ抑制剂组（KH064,n=10）。SO组仅行剖腹术,翻动胰腺。QYT组在建立SAP模型后30 min、12 h清胰汤灌胃（10 mL/kg）。DEX组于造模后30min、12h静脉注射地塞米松（10mg/kg）。SS组在造模后30min、12h皮下注射善宁（50μg/kg）。KH064组于造模后30min、12h给予KH064灌胃（5mg/kg）。各组动物在术后24 h测PaO2、PaCO2、pH和血淀粉酶、sPLA2、肺湿/干比。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肺组织SP-A、sPLA2-ⅡmRNA的表达强度,采用Western-blot检测肺组织SP-A、sPLA2-Ⅱ表达,免疫组化观察肺组织SP-A表达,并观察胰、肺病理变化及ATⅡ细胞的电镜下变化。实验二:采用Dobbs方法提取ATⅡ细胞,首先肺动脉灌洗减少肺内红细胞,肺离体后经气管灌洗除去肺泡腔内的白细胞,将胰蛋白酶、胶原酶灌入肺内消化分离细胞;采用免疫贴附法纯化细胞,巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞表面有IgG的Fc段受体,将细胞悬液培养于覆被IgG的平皿中,有Fc段受体的细胞被粘附,而无Fc段受体的ATⅡ细胞得以纯化。ATⅡ细胞的鉴定采用电子显微镜和SP-A免疫组化染色,其在电子显微镜下有特征性板层小体,免疫组化染色见细胞浆有SP-A表达。实验三:10只雄性SPF SD大鼠,采用胆胰管内逆行注入1.5%去氧胆酸钠建立大鼠SAP时ALI模型,留取腹水,检测腹水sPLA2活性后分装,-80℃保存。按前述方法分离、提取、培养ATⅡ细胞,腹水预处理按腹水终浓度为12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml和100μl/ml加入培养液,分6、12、24h三个时点,采用MTT法测定细胞增殖情况和细胞生存率。根据细胞增殖情况,选用腹水预处理浓度为25μl/ml,预处理时间24h,培养孔KH064干预终浓度为:0μg /ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml,培养孔Emodin干预终浓度为:0μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml,用MTT法测定细胞增殖情况,根据实验结果选择药物干预剂量为:KH064 1μg/ml、2μg/ml,Emodin 10μg/ml,20μg/ml。腹水预处理组腹水剂量分别为:12.5、25、50、100μl/ml培养液,预处理时间为24h。腹水预处理组和药物干预组分别提取RNA和蛋白,检测SP-A mRNA和蛋白的表达。电子显微镜观察ATⅡ细胞。结果:SAP组血淀粉酶显著高于SO组和各治疗组（P<0.05）。SAP组PaO2、pH显著低于SO组和治疗组（P<0.05）, SAP组PaCO2、肺W/T显著高于SO组和治疗组（P<0.05）。SAP组血清sPLA2显著高于SO组（P<0.05）,QYT、DEX、KH064组血sPLA2与SAP组比较有显著降低（P<0.05）,SS组血sPLA2与SAP组比较差别无显著性。SAP组SP-A mRNA表达较SO组显著降低（P<0.05）,QYT、DEX、KH064组SP-A mRNA表达较SAP组显著增高（P<0.05）,SS组SP-A mRNA表达与SAP组比较无显著变化。各组SP-A mRNA表达与肺损伤评分呈负相关（P<0.05）。SO组SP-A蛋白有明显表达,与SO组比较,SAP组SP-A表达显著降低,治疗组与SAP组比较SP-A表达增高,其中QYT、DEX、KH064组增高明显。肺组织免疫组化SAP组SP-A表达较SO组显著降低（P<0.05）,各治疗组SP-A表达较SAP组有显著增高（P<0.05）。与SO组比较SAP组sPLA2-ⅡmRNA、蛋白表达显著增高,除SS组外其他各治疗组sPLA2-ⅡmRNA、蛋白表达较SAP组显著降低。治疗组肺组织病理及电镜改变较SAP组明显好转,以QYT、KH064组好转明显。纯化前可得约5×108个ATⅡ细胞/只鼠,IgG免疫粘附纯化后细胞数约为1.6×107个/只。台盼蓝染色显示细胞活力为95%以上。通过SP-A免疫组化染色判定,纯化后ATⅡ细胞纯度可达92%。光学显微镜检查见随预处理腹水剂量增加,细胞生长状态变差,并出现细胞死亡。KH064、Emodin干预组细胞生长良好。MTT结果显示,腹水呈剂量依赖方式抑制大鼠ATⅡ细胞生长,细胞生存率随培养时间的延长降低。KH064浓度为0.5-2μg /ml时,细胞增殖较对照组明显增高,并呈剂量依赖性;Emodin浓度为10-40μg/ml时,细胞增殖较对照组有显著增高,并呈剂量依赖性。随着干预腹水浓度的增高, ATⅡ细胞SP-AmRNA的表达降低,表现出明显的剂量依赖性。KH064和Emodin干预组SP-AmRNA的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,各干预组不同剂量之间SP-AmRNA的表达水平无显著差别（P>0.05）。腹水预处理组ATⅡ细胞SP-A蛋白表达显著低于对照组,并随腹水预处理剂量的增高SP-A的表达降低,呈现剂量依赖性。KH064和Emodin干预组ATⅡ细胞SP-A蛋白的表达水平显著高于对照组。KH064和Emodin干预组ATⅡ细胞电子显微镜下改变较腹水预处理组明显减轻。结论:急性胰腺炎肺损伤时,ATⅡ细胞结构破坏,导致SP-AmRNA表达减少,进而使肺表面活性物质中SP-A表达降低,其对sPLA2-II抑制作用降低,使后者表达增高,从而加速肺泡表面活性物质磷脂水解,导致肺泡表面张力增加,肺泡萎陷,最终导致ARDS。SP-A和sPLA2- II的平衡在急性胰腺炎肺损伤发生中起关键作用。中药清胰汤在急性胰腺炎肺损伤时起保护ATⅡ细胞的作用,增加肺组织SP-A表达,同时降低肺组织sPLA2- II表达,具有维持肺泡表面活性物质的功能,从而保持良好肺泡表面张力,防止ALI。地塞米松可能通过减轻炎症反应,间接增加肺组织SP-A的表达,降低肺组织sPLA2-II的表达,实现保护肺功能的作用。善宁明显降低急性胰腺炎血淀粉酶水平,对SP-A、sPLA2- II表达无显著影响。分离、纯化大鼠ATⅡ细胞时,合适的胰蛋白酶浓度及作用时间对细胞活性有重要作用,大鼠IgG粘附纯化可以得到高纯度的ATⅡ细胞,可以通过电子显微镜观察板层小体和免疫组化染色检测细胞SP-A表达鉴定ATⅡ细胞。胰腺炎腹水抑制ATⅡ细胞增殖,随着腹水浓度增高、作用时间延长其对细胞增殖的抑制作用增强,表现出明显剂量、时间依赖性。sPLA2-Ⅱ抑制剂可以减轻腹水对ATⅡ细胞的损伤,表明腹水中对细胞损伤起主要作用的物质可能是sPLA2-Ⅱ。Emodin也有减轻腹水对ATⅡ细胞的损伤作用,其可能主要通过抑制sPLA2-Ⅱ活性,减轻腹水中sPLA2-Ⅱ对ATⅡ细胞的损伤作用而保护细胞功能。腹水预处理使ATⅡ细胞SP-AmRNA、蛋白表达较对照组减少,表明腹水中有抑制SP–A表达物质,应用sPLA2-Ⅱ抑制剂KH064、Emodin可以使SP–A表达增高,表明这两种药物可减轻细胞损伤,通过增加ATⅡ细胞SP-A表达而起防止肺损伤的作用。