siRNA干扰ES细胞nanog基因及nanog基因真核表达载体的构建

论文题目: siRNA干扰ES细胞nanog基因及nanog基因真核表达载体的构建

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 庄淑珍

导师: 窦忠英

关键词: 细胞,干扰,基因,表达载体,半定量

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: RNA 干扰（RNAi）现象普遍存在于生物体细胞中,在理论上已清楚其分子机制,为干细胞研究提供了新的方法。应用RNAi技术研究基因功能和干细胞的维持及定向分化调控具有广阔的发展前景。在ES 细胞多能性维持和定向分化研究中,同源异型蛋白Nanog是目前已知的唯一不依赖于LIF/Stat3 途径维持内细胞团（ICM）和胚胎干细胞（ES细胞）多潜能性的因子,主要在早期胚胎细胞和ES 细胞中表达,并且与LIF/Stat3、Oct4在早期胚胎细胞和ES 细胞中的表达有一定的时序关系。研究nanog 基因在ES 细胞中的表达机制以及与LIF/STAT3 和Oct4 之间对干细胞多能性的关系,将有助于理解ES细胞多能性维持的分子机理。本研究构建了针对小鼠ES 细胞nanog 基因的瞬时干扰载体和稳定干扰载体,旨在通过RNAi技术干扰nanog 基因的表达,以研究nanog 基因缺失的ES 细胞生物学特性改变。成功构建的含有小鼠nanog 基因从起始密码子到终止密码子整个阅读框的重组表达载体,为下一步将表达外源Nanog 蛋白的重组成体分化细胞和nanog 基因干扰的ES细胞相结合,进一步研究nanog 基因在ES 细胞中多能性维持机理奠定了基础。本研究主要包括以下5 个方面: 1. 以nanogB、nanogC 为引物,从小鼠ES-D3 细胞中克隆出与预期大小相符的（749 bp） nanog 基因。采用GenBank 中Align 软件对其进行了序列分析,结果表明,所获得的序列与GenBank 中小鼠ES 细胞nanog 基因（XM132755, gi: 20831594）相应序列同源性达99.5%,证明用小鼠ES-D3 细胞研究nanog 基因在ES 细胞中的作用是可行的。2. 观察ES-D3 细胞在小鼠成纤维细胞（MEF）、新生牛睾丸支持细胞（nBTSCs）和新生兔睾丸支持细胞（nRTSCs）饲养层上生长4 d 后nanog 基因的表达水平和生长行为。半定量RT-PCR 分析显示,MEF 饲养层上培养4 d 的ES-D3 细胞nanog 基因含量高于在其它两种饲养层上培养的含量。MEF 饲养层上的ES 细胞克隆形成率（CFE）明显高于nBTSC饲养层和nRTSC 饲养层上的ES 细胞CFE。结果表明,在不同饲养层上培养至第4 天的ES-D3 细胞集落形态和分化程度有差异。MEF 饲养层上的ES-D3 细胞培养至第4 天时,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,AKP 染色强阳性。在nBTSC饲养层上的ES-D3 细胞,集落界限清晰,AKP 染色显示,集落中大部分细胞呈阳性,

论文目录:

综述部分

第一章 ES 细胞多能性维持与分化机理研究进展

1.1 外源性信号

1.1.1 LIF 及其信号转导系统对ES 细胞多能性的维持

1.1.2 STAT3 对ES 细胞多能性的维持

1.1.3 BMP 信号通路

1.1.4 Wnt 信号通路

1.2 内源性调节因子

1.2.1 Oct4 对ES 细胞多能性的维持

1.2.2 Nanog对ES 细胞多能性的维持

1.2.2.1 nanog 基因编码一个特异的同源异型蛋白

1.2.2.2 Nanog的表达

1.2.2.3 由Ecat4/Nanog维持的LIF-非依赖性细胞自我更新

1.2.2.4 Nanog缺失的ES 细胞失去多能性

1.2.2.5 Nanog缺失胚胎不能形成外胚层

1.2.2.6 Nanog维持ES 细胞自我更新能力机制

1.2.3 Nanog与LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持的关系

1.2.3.1 LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持相互关系

1.2.3.2 Nanog与LIF、Stat3、Oct4 对ES 细胞多能性维持的比较

1.3 展望

第二章 RNAi与干细胞研究

2.1 RNAi的分子机理

2.1.1 siRNA 生成

2.1.2 RISC 的形成

2.1.3 RNAi效应

2.2 细胞中产生siRNA的方法

2.2.1 长的dsRNA

2.2.2 siRNA

2.2.3 siRNA 库

2.2.4 DNA 载体介导的RNAi

2.2.5 病毒载体介导的RNAi

2.2.5.1 慢病毒载体(Lentiviral vector, LV)

2.2.5.2 腺病毒载体(Adenoviral vector, AV)

2.2.5.3 腺病毒相关载体(Adenoviral-associated vectors, AAV)

2.3 干细胞中的RNAi现象

2.4 RNAi在干细胞研究中的应用

2.4.1 利用RNAi技术研究ES 细胞

2.4.2 RNAi在造血干细胞(HSCs)中的研究

2.5 研究干细胞RNAi效应的方法

2.5.1 干细胞基因的标记

2.5.2 dsRNA 的转染方法

2.5.2.1 直接注射法

2.5.2.2 脂质体介导的转染

2.5.2.3 电穿孔法

2.5.3 siRNA 干扰干细胞特异功能基因检测方法

2.5.3.1 用RT-PCR 检测干细胞被干涉的目的m RNA的转录水平

2.5.3.2 用Western-blot 分析被干涉基因的蛋白质表达水平

2.5.3.3 检测干细胞生物学特性

2.6 展望及存在的问题

研究部分

前言

第三章小鼠ES 细胞nanog 基因的克隆及序列分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 细胞

3.1.1.2 质粒与菌株

3.1.1.3 酶及主要试剂

3.1.1.4 仪器与设备

3.1.1.5 溶液配制

3.1.2 方法与步骤

3.1.2.1 引物设计及合成

3.1.2.2 细胞培养与总RNA 的提取

3.1.2.3 RT-PCR

3.1.2.4 纯化回收DNA 片段

3.1.2.5 纯化产物与pMD18-T Vector 连接

3.1.2.6 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)

3.1.2.7 连接产物的转化

3.1.2.8 重组质粒的提取

3.1.2.9 重组质粒的酶切和PCR 鉴定及测序分析

3.2 结果

3.2.1 ES-D3 细胞在小鼠MEF 饲养层上的生长行为

3.2.2 cDNA 合成及PCR

3.2.3 重组质粒的酶切和PCR 鉴定及测序分析

3.3 讨论

3.3.1 nanog 基因的克隆

3.3.2 RNase 的存在与否及引物的设计是RT-PCR 成败的关键

3.3.3 nanog 基因是一个高度保守的基因

3.4 小结

第四章小鼠ES 细胞在不同饲养层上培养nanog 基因的表达水平与生长行为

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.1.1 细胞

4.1.1.2 质粒与菌株

4.1.1.3 酶及主要试剂

4.1.1.4 主要仪器与设备

4.1.1.5 溶液配制

4.1.2 方法

4.1.2.1 引物设计及合成

4.1.2.2 细胞培养与总RNA 的提取

4.1.2.3 ES 细胞nanog 基因表达的半定量RT-PCR 检测

4.1.2.4 不同饲养层细胞的制备

4.1.2.5 AKP 染色

4.1.2.6 ES-D3 细胞在不同饲养层上的传代培养

4.1.2.7 不同饲养层上ES-D3 细胞克隆形成率的测定

4.2 结果与分析

4.2.1 cDNA 合成及RT-PCR 结果

4.2.2 ES-D3 细胞在不同饲养层上的生长表现

4.2.2.1 ES-D3 细胞在小鼠MEF 饲养层上的生长表现

4.2.2.2 ES-D3 细胞在nBTSC 饲养层上的生长表现

4.2.2.3 ES-D3 细胞在nRTSC 饲养层上的生长表现

4.2.3 不同饲养层上ES-D3 细胞的克隆形成率

4.3 讨论

4.3.1 半定量RT-PCR 可以检测ES 细胞中Nanog表达水平

4.3.2 MEF 饲养层有利于ES 细胞的生长扩增

4.4 小结

第五章ES-D3 细胞nanog 基因干扰载体的构建及其干涉效果

5.1 材料和方法

5.1.1 材料

5.1.1.1 细胞

5.1.1.3 酶及主要试剂

5.1.1.4 仪器与设备

5.1.1.5 溶液配制

5.1.2 方法

5.1.2.1 nanog 基因siRNA表达载体的构建

5.1.2.2 nanog 基因siRNA表达载体的酶切鉴定

5.1.2.3 ES-D3 细胞转染和培养

5.1.2.4 RT-PCR 引物的设计及合成

5.1.2.5 ES-D3 细胞nanog 基因RNA 干涉的半定量RT-PCR 检测

5.1.2.6 ES 细胞的生长特性及AKP 染色

5.2 结果和分析

5.2.1 nanog 基因siRNA表达载体的酶切鉴定

5.2.2 ES-D3 细胞转染效率估测

5.2.3 RNAi效果的半定量RT-PCR 检测

5.2.4 干涉后ES-D3 细胞的生长和特性

5.3 讨论

5.3.1 RNAi技术是研究基因组功能的重要工具

5.3.2 直接用转染液重悬消化的细胞可以提高转染效率

5.3.3 nanog 基因暂时性干扰的ES 细胞仍保持未分化状态和多能性

5.4 小结

第六章以RNAi技术研究nanog 基因对ES 细胞多能性的维持

6.1 材料和方法

6.1.1 材料

6.1.1.1 质粒与细胞株

6.1.1.2 主要试剂

6.1.1.3 主要仪器

6.1.1.4 溶液配制

6.1.2 方法

6.1.2.1 稳定干扰载体pGsi305 的构建

6.1.2.2 质粒DNA 的大量制备及其纯化按文献方法进行

6.1.2.3 稳定干扰载体pGsi305 转染ES-D3 细胞及筛选

6.1.2.4 ES-D3 细胞nanog 基因RNA 干涉的半定量RT-PCR 检测

6.1.2.5 干扰ES-D3 细胞形态观察及AKP、SSEA-1、c-kit、Oct4 染色

6.1.2.6 ES-D3 细胞和小鼠MEF 细胞抗G418 最佳浓度筛选

6.2 结果与分析

6.2.1 重组稳定干扰载体的酶切鉴定

6.2.2 阳性转染ES-D3 细胞的效率检测

6.2.3 RNAi效果的半定量RT-PCR 检测

6.2.4 干涉后ES-D3 细胞的生长和特性

6.2.5 ES-D3 细胞和小鼠MEF 细胞抗G418 最佳浓度筛选

6.3 讨论

6.3.1 pGsi305 重组干扰载体的构建

6.3.2 稳定干扰细胞的筛选

6.3.3 nanog 基因敲除的ES 细胞丧失其多能性的特征

6.4 小结

第七章小鼠ES 细胞nanog 基因真核表达载体的构建

7.1 材料与方法

7.1.1 材料

7.1.1.1 细胞

7.1.1.2 质粒与菌株

7.1.1.3 酶及主要试剂

7.1.1.4 仪器与设备

7.1.1.5 溶液配制

7.1.2 方法与步骤

7.1.2.1 引物设计及合成

7.1.2.2 细胞培养与总RNA 的提取

7.1.2.3 重组载体pNA992 的构建及鉴定

7.1.2.4 重组表达载体pG-bnanog的构建及鉴定

7.2 结果

7.2.1 克隆片段的RT-PCR 及重组质粒的鉴定

7.2.2 表达引物的PCR 扩增及重组质粒的鉴定

7.2.3 重组表达载体pG-bnanog的鉴定

7.3 讨论

7.3.1 重组表达质粒构建采用pMD-18T 载体

7.3.2 表达引物的设计

7.3.3 表达载体的选择

7.4 小结

结论

创新点

进一步研究的课题

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

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