苦参碱促进肿瘤细胞凋亡及其机制的实验研究

论文摘要

目的:当前恶性肿瘤的发病率逐年增加,已经成为严重威胁人类健康的一大杀手,对恶性肿瘤的防治成为医务工作者面临的重要课题。越来越多的研究表明肿瘤发生不仅是由于瘤细胞的过度增生,还因为瘤细胞死亡过少,凋亡机制障碍。细胞凋亡参与肿瘤起始过程,并对肿瘤发生发展起负调控作用。本研究运用多种实验技术,探讨苦参碱（matrine）对人卵巢癌细胞A21-2和人骨肉瘤细胞MG63的增殖抑制和诱导凋亡效应,并对促凋亡因子caspase-3进行进行检测和分析,以期进一步阐明苦参碱抗癌的作用机制,为苦参碱的抗癌治疗提供实验基础。方法:将A21-2细胞和MG63细胞置于37℃,饱和湿度5%的CO2培养箱常规条件下培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化:将不同浓度的苦参碱作用于A21-2细胞和MG63细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2透射电子显微镜观察:0.6mg/ml的苦参碱作用A21-2细胞和MG63细胞72h后收集细胞,体积分数为2.5%戊二醛4℃固定,用10g/L锇酸后固定,丙酮系列脱水,最后用Epon812环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀与柠檬酸铅双重染色,电镜下观察并照相。3采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测药物对细胞的生长抑制作用。4流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡、细胞周期分布:收集经苦参碱作用72h的A21-2细胞和MG63细胞及对照组细胞,冷PBS漂洗,预冷70%乙醇,4℃固定,上机检测前离心去固定液,0.5%胃蛋白酶消化,碘化丙锭（Propidium Iodide,PI:50mg/L Trinton X-100 1.0%）室温避光染色。流式细胞仪上机检测,应用软件进行分析。5 FCM检测Caspase-3蛋白的表达:收集经苦参碱作用72h的A21-2细胞和MG63细胞及对照组细胞,按常规方法进行荧光标记,流式细胞仪检测荧光强度,以荧光指数（FI）表示蛋白的表达情况。6反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Caspase-3mRNA的表达:利用TRIZOL试剂盒提取经苦参碱作用72h后的A21-2细胞、MG63细胞及对照组细胞RNA,反转录、扩增后得到的PCR产物经8%聚丙烯酰氨凝胶电泳,溴化乙锭（EB）显色,Bio-profif凝胶图像分析系统进行摄像分析。结果:（1）经0.2、0.4、0.6mg/ml苦参碱处理A21-2细胞和MG63细胞72h后,倒置相差显微镜下观察,与对照组相比,用药组的细胞生长明显被抑制,胞浆内颗粒增多增粗,部分细胞变圆而悬浮在培养基内。透射电镜下观察到染色体凝集边聚,粗面内质网肿胀,细胞表面出现空泡。（2）分别用苦参碱（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml）作用于A21-2细胞和MG63细胞48、72h,MTT结果显示苦参碱能明显抑制A21-2细胞和MG63细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。作用48h和72h后,A21-2细胞半数抑制率（inhibitory concentration giving 50% inhibition, IC50）分别为1.017mg/ml、0.751 mg/ml,MG63细胞半数抑制率（inhibitory concentration giving 50% inhibition, IC50）分别为1.019mg/ml与0.701mg/ml。1.0mg/ml苦参碱作用A21-2细胞和MG63细胞72h后抑制率可分别达到71.89%、71.16%（p<0.01）。（3）FCM分析发现,0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦参碱处理细胞72h后,G0/G1期前面出现凋亡峰。A21-2细胞凋亡率分别为13.54%±0.39%、17.93%±0.19%、26.35%±0.11%,细胞G0/G1期比例由对照组54.12%±1.23%升至59.35%±1.31%,67.52%±0.42%,77.53%±0.19%, S期、G2/M期细胞比例减少,MG63细胞凋亡率分别为11.37%±0.53%、14.28%±0.16%、24.13%±0.23%（p<0.01）,处理后的细胞G0/G1期比例增高（由对照组63.21%±1.52%升至69.14%±1.12%,75.31%±0.33%,82.64%±0.16%）。caspase-3蛋白表达升高, A21-2细胞的荧光指数分别为1.60±0.03、1.78±0.02、2.08±0.05,MG63细胞的荧光指数分别为1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02。（4）RT-PCR结果表明:经0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦参碱处理A21-2细胞和MG63细胞72h后,随着药物浓度的增加,Caspase-3mRNA表达均逐渐升高。结论:1苦参碱能明显抑制肿瘤细胞MG63和A21-2增殖,使细胞周期受到阻滞,并进一步诱导其凋亡。2苦参碱抗肿瘤的作用机制可能与促进Caspase-3的表达有关。其它机制有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 苦参碱促进肿瘤细胞凋亡及其机制的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 苦参碱抗肿瘤作用的研究进展
• 致谢
• 个人简历