论文摘要
目的:食管下括约肌是食管胃连接部增厚的肌束,由内层大弯侧的套索纤维（sling fibers）和小弯侧半环形的钩状纤维（clasp fibers）构成,这两束肌肉共同维持LES的关闭状态,其收缩和舒张功能调节机制非常复杂,包括神经系统、体液因素以及自身肌源性因素等多种因素。胃肠肽类激素作为体液因素的主要组成部分,承担着不可替代的作用。CCK是一类能引起胆囊收缩的胃肠道多肽激素,具有调节胆囊收缩,胰腺分泌,促进?胃排空等功能。现在,CCK成为一类典型的脑肠肽,能够以神经递质或神经调质的形式发挥生理作用,所有这些生理作用都是其作用于相应受体而产生的结果。CCK受体根据其对CCK类似物和胃泌素及特异拮抗剂的亲和力差异而分为两种亚型—CCKA受体和CCKB受体,并且有人将胃泌素受体与CCKB受体统称为CCKB胃泌素受体。本研放射配基受体结合分析法,研究CCKA受体和CCKB受体与其激动剂3H-CCK-8s的结合力,以及两个受体分别在人的LES的钩状纤维和套索纤维的表达情况,以证明哪种受体和那条肌纤维对LES的调节作用更占优势。方法:选取2005年12月至2006年5月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者7例,采集未受侵的套索纤维和钩状纤维,制成约812mm×46mm的肌条,1)用组织匀浆器加入TBS液4℃匀浆,匀浆液以4℃,1000×g离心10分钟。2)弃上清后,采用美国PIERCE公司的膜蛋白提取试剂盒,将沉淀运用膜蛋白萃取法制备受体膜蛋白,考马斯亮蓝G-250定量后存于-80℃备用。3)取等量受体膜蛋白用蛋白印迹法证实CCKA受体和CCKB受体在LES的存在及初步比较其条带。4)以3H-CCK-8s为标记配基,用反应体系总体积为200μl ,使得3H-CCK-8s与CCK受体充分结合,4℃恒温振荡孵育10h ,进行饱和试验。然后分别加入CCKA受体拮抗剂CR1409和CCKB受体拮抗剂CR2945至反应体系重复前面的过程进行竞争抑制试验。以49型硝基玻璃纤维滤膜采用负压抽滤的办法分离结合和游离配基,含有结合配基受体的滤膜置于液体闪烁计数仪中计数。实验结果用Graphpad Prism4软件和SPSS11.5软件分析。结果:1由蛋白印迹试验得出CCKA受体和CCKB受体在钩状纤维和套索纤维均表达,钩状纤维上, CCKA受体和CCKB受体表达的IOD值为22.328±1.042和12.454±0.294,二者有统计学差异（t=9.118,p=0.001）,在套索纤维上,CCKA受体和CCKB受体表达的IOD值为22.650±0.642和13.195±0.423,二者有统计学差异（t=12.299, p=0.000）,但是CCKA受体在套索纤维上和钩状纤维上无统计学差异（t=0.263, p=0.806） ,CCKB受体在套索纤维上和钩状纤维上无统计学差异（t=1.439, p=0.224）。2饱和试验中得出饱和曲线,并得出在LES的套索纤维上3H-CCK-8s与CCK受体的最大结合量Bmaxs为595.750±3.231cpm ,平衡解离常数Kds为1.671±0.024mmol/L,而在钩状纤维上二者的最大结合量Bmaxc为500.000±10.087cpm,Kdc为1.437±0.024mmol/L。CCK受体与3H-CCK-8s的最大结合量在钩状纤维和套索纤维上有统计学差意义（t=9.040,p=0.000）,平衡解离常数在钩状纤维和套索纤维上有统计学差意义（t=6.898,p=0.000）,同时由数据可以看出套索纤维上的CCK受体与3H-CCK-8s的结合较多。3竞争抑制实验中得出CCKA受体和CCKB受体拮抗剂的竞争抑制曲线,同时在LES的套索纤维上CR1409的半量有效抑制浓度EC501409为2.798±0.104×10-9 mol/L,CR2945的半量有效抑制浓度EC502945为8.147±0.551×10-9 mol/L ,二者对3H-CCK-8s和CCK受体结合的抑制作用有统计学差异（t=9.53,p=0.001）,而在钩状纤维上CR1409的半量有效抑制浓度EC501409为3.165±0.187×10-9 mol/L, CR2945的半量有效抑制浓度EC502945为9.583±0.501×10-9 mol/L,二者对3H-CCK-8s和CCK受体结合的抑制作用有统计学差异（t=11.99,p =0.000）,而且CR1409的抑制作用大于CR2945的。但是CR1409在钩状纤维和套索纤维上无统计学差异（t=1.72,p=0.161）,CR2945在钩状纤维和套索纤维上无统计学差异（t=1.93, p =0.126）。结论:1 3H-CCK-8s与钩状纤维和套索纤维上CCK受体的结合为特异性结合,套索纤维上3H-CCK-8s与CCK受体结合的情况优于钩状纤维上的情况。2 CCKA受体拮抗剂CR1409对3H-CCK-8s与LES的CCKA受体的特异性结合的抑制作用比CCKB受体拮抗剂CR2945更明显。3两肌条间拮抗剂与各自受体的亲和力无差别。4饱和曲线所得出的CCK受体与3H-CCK-8s的最大结合量和平衡解离常数在钩状纤维和套索纤维上的差异可由CCKA受体在套索纤维比钩状纤维分布较多引起的。因此CCKA受体在CCK-8s对LES的调节作用中承担着更为重要的药理学作用。因此CCKA受体在CCK-8s对LES的调节作用中,承担着更为重要的药理学作用。
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标签：受体论文; 放射配基受体结合实验方法论文; 食管下括约肌论文;