基于荧光纳米颗粒标记的芯片介电电泳技术检测沙门氏菌

论文摘要

病原菌检测作为重要的衡量指标，在食品安全、疾病诊断、环境监测等领域具有重要意义。现已发展成熟的病原菌检测方法如培养基法、分子生物学法、酶联免疫法、流式细胞术等在病原菌检测中发挥了重要作用。然而，这些方法仍然存在耗时、操作繁琐、价格昂贵、不连续等局限性。因此建立一种灵敏、连续、实时的病原菌检测方法十分必要。纳米材料由于具有许多传统材料所不具备的优点，已被广泛应用于生物医学分析等领域。特别是荧光纳米颗粒具有荧光强度高和光稳定性较好等优点，因此能起到增强信号强度，大大提高分析检测灵敏度的作用。同时，融合介电电泳原理和微流控芯片技术发展起来的集成芯片介电电泳技术，不仅能对细胞、细菌等复杂生化样品进行高效迅速富集和分离，而且具有易与功能化纳米颗粒分析方法相结合的优势，为少量样品实时连续的超灵敏检测提供了新思路。本论文以病原菌快速、灵敏检测这一热点问题为切入点，通过结合功能化荧光纳米颗粒标记技术和微流控芯片介电电泳检测技术，围绕沙门氏菌的连续、高灵敏检测，主要开展了以下两方面的研究工作：一、基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌利用融合了介电电泳原理和微流控芯片的集成芯片介电电泳技术，并结合功能化荧光纳米颗粒信号放大效应，发展了一种简单、快速、连续、高灵敏的沙门氏菌检测方法。在考察了沙门氏菌的介电性质基础上，首先将识别鼠伤寒沙门氏菌的特异性抗体修饰到具有信号增强作用的包裹钌吡啶染料的羧基化二氧化硅荧光纳米颗粒表面，通过抗原-抗体的特异性识别，实现对目标菌的标记；随后利用微流控芯片进行连续进样，并采用介电电泳富集技术对沙门氏菌进行迅速、实时、定向富集；最后通过监测富集区域荧光信号的强度，实现对沙门氏菌的定量检测。结果表明，该方法可以在去离子水和实际水样中迅速、灵敏的检测到沙门氏菌，检测限为56cfu/mL，检测用时仅需40min。该方法的主要特点在于，采用功能化荧光纳米颗粒作为标记可以获取更高强度和更稳定的信号，同时利用微流控芯片介电电泳技术可以对沙门氏菌进行实时在线检测。该方法有望成为病原菌检测的通用方法。二、基于核酸适体识别的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌利用核酸适体的诸多优点，如高亲和力、高特异性、易合成和标记、易储存且成本低等，在上一章的研究基础上，引入对目标菌具有特异性识别能力的核酸适体替代抗体，同样基于功能化荧光纳米颗粒标记的微流控芯片介电电泳技术，实现了对沙门氏菌的快速、便捷、连续和高灵敏检测。首先将鼠伤寒沙门氏菌的特异性核酸适体修饰到包裹钌吡啶染料的荧光纳米颗粒表面，再与目标菌孵育，通过核酸适体对靶目标的特异性识别，将纳米颗粒的荧光标记到沙门氏菌上；再将样品通入到微流控芯片中，利用介电电泳富集技术，实现对鼠伤寒沙门氏菌的连续、在线富集检测，检测限为280cfu/mL。相比抗原-抗体反应，该方法利用的核酸适体识别技术可将孵育标记时间缩短一半，有望实现更为快速、更为便捷的病原菌检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 沙门氏菌的危害及检测意义
• 1.2 常见的沙门氏菌检测方法
• 1.2.1 微生物培养法
• 1.2.2 分子生物学法
• 1.2.3 免疫学法
• 1.3 介电电泳驱动的微流控芯片技术
• 1.3.1 介电电泳技术
• 1.3.2 微流控芯片技术
• 1.3.3 介电电泳驱动的微流控芯片技术
• 1.4 纳米材料信号放大效应用于病原菌检测
• 1.4.1 量子点
• 1.4.2 碳纳米管
• 1.4.3 二氧化硅纳米颗粒
• 1.5 本文构思
• 第2章 基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 电极的设计与微流控芯片的键合
• 2.2.3 功能化二氧化硅荧光纳米颗粒的制备和表征
• 2.2.4 功能化二氧化硅荧光纳米颗粒的生物修饰
• 2.2.5 细菌培养与样品制备
• 2.2.6 生物修饰的功能化二氧化硅荧光纳米颗粒对沙门氏菌的识别
• 2.2.7 实验条件的优化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌实验原理
• 2.3.2 功能化二氧化硅荧光纳米颗粒的表征
• 2.3.3 生物修饰的功能化二氧化硅荧光纳米颗粒对鼠伤寒沙门氏菌的识别考察
• 2.3.4 鼠伤寒沙门氏菌的介电属性考察
• 2.3.5 检测条件的优化
• 2.3.6 基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术在线富集检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度考察
• 2.3.7 与基于荧光染料直接标记的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度比较
• 2.3.8 基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术在线富集检测鼠伤寒沙门氏菌的特异性考察
• 2.3.9 基于不同荧光纳米颗粒标记的微流控芯片介电电泳技术用于混合菌的同时检测
• 2.3.10 基于荧光纳米颗粒信号增强的微流控芯片介电电泳技术在实际水样中的检测应用
• 2.4 小结
• 第3章 基于核酸适体识别的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 电极的设计与微流控芯片的键合
• 3.2.3 二氧化硅荧光纳米颗粒的制备与表征
• 3.2.4 二氧化硅荧光纳米颗粒表面核酸适体的修饰
• 3.2.5 细菌的培养与样品制备
• 3.2.6 核酸适体修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒对鼠伤寒沙门氏菌特异性识别的考察
• 3.2.7 实验条件的优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 基于核酸适体识别的微流控芯片介电电泳技术检测鼠伤寒沙门氏菌实验原理
• 3.3.2 二氧化硅荧光纳米颗粒的表征
• 3.3.3 Sal aptamer 对鼠伤寒沙门氏菌的特异性识别考察
• 3.3.4 实验条件的优化
• 3.3.5 基于核酸适体识别的微流控芯片介电电泳技术在线富集检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度考察
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录