外消旋布洛芬酶法拆分的研究

论文摘要

论文以有机介质中脂肪酶催化（R,S）—布洛芬的高选择性拆分为目标,开展了有关方面的研究:首先,确立了HPLC拆分（R,S）—布洛芬两个对映体及布洛芬酯的方法,并通过筛选得到一株高选择性拆分消旋布洛芬的脂肪酶产生菌——Penicilliumexpansum TS414。其次,研究游离脂肪酶催化布洛芬不对称酯化反应过程中,水分含量、有机溶剂、底物醇种类及浓度、酶粉与水分的比例、反应温度等条件对拆分效果的影响,确立的最佳反应体系为:异辛烷15mL,布洛芬6.46mmol/L,脂肪酶53.3g/L,酶量:水量=10∶1,正丙醇40mmol/L,含水量0.5%,60℃反应50h。在此条件下,拆分反应的底物转化率和底物选择率分别为42%、429.63。然后,确立了Penicillium expansum TS414脂肪酶的固定化的最佳条件:AB-8大孔树脂作为吸附载体,酶与树脂比例为6∶1、缓冲液pH值为9.0、吸附6h、冻干2h;运用均匀实验优化了布洛芬、醇浓度和固定化酶的最佳用量:15mL异辛烷体系中,布洛芬20.84mg,正丙醇42.26μL,固定化酶0.6g,在摇床转速和反应温度分别为200rpm和40℃时,ees的预测值为75.45%。通过验证实验,得到ees的实验值为81.12%。在此条件下,拆分反应的转化率和对映体选择率E值分别为48.15%和661.35;固定化酶对消旋布洛芬拆分的效果较为理想。最后,研究并确定了固定化Penicillium expansum TS414脂肪酶催化（R,S）—布洛芬酯化拆分的动力学方程。利用origin 7.5软件对原始数据进行非线性拟合,得到了Penicillium expansum TS414脂肪酶催化酯化反应的动力学常数:Vmax=1.11173mmol/h.L,KA=4.64111mmol/L,KB=0.25143mmol/L,KiB=182.31537mmol/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 脂肪酶的研究进展
• 1.1.1 脂肪酶的筛选
• 1.1.1.1 脂肪酶概述
• 1.1.1.2 脂肪酶的筛选
• 1.1.2 脂肪酶的酶学特性
• 1.1.2.1 脂肪酶的分子结构
• 1.1.2.2 脂肪酶的底物特异性
• 1.1.3 脂肪酶的固定化
• 1.1.3.1 固定化酶的意义
• 1.1.3.2 固定化酶的方法
• 1.2 布洛芬等手性药物拆分研究进展
• 1.2.1 手性药物研究概述
• 1.2.2 布洛芬等手性药物的拆分方法
• 1.2.2.1 物理结晶法
• 1.2.2.2 化学法
• 1.2.2.3 生物学法
• 1.3 2-芳香丙酸类手性药物的酶法拆分
• 1.3.1 2-芳香丙酸类手性药物概述
• 1.3.2 2-芳香丙酸类手性药物酶法拆分方法
• 1.3.2.1 2-芳香丙酸类药物的水解拆分
• 1.3.2.2 2-芳香丙酸类药物的转酯化拆分
• 1.3.2.3 2-芳香丙酸类药物的酯化拆分
• 1.3.3 2-芳香丙酸类手性药物酶法拆分的影响因素
• 1.3.3.1 非水介质中水分含量对酶促拆分反应的影响
• 1.3.3.2 非水介质中溶剂极性对酶促拆分反应的影响
• 1.3.3.3 非水介质中添加剂对酶促拆分反应的影响
• 1.3.3.4 非水介质中温度对酶促拆分反应的影响
• 1.3.3.5 非水介质中pH对酶促拆分反应的影响
• 1.4 本论文的研究思路及主要内容
• 第2章 HPLC分析方法的建立及脂肪酶的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 脂肪酶
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.2.4.1 霉菌培养基
• 2.2.4.2 细菌培养基
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.5.1 菌种培养和摇瓶发酵方法
• 2.2.5.2 布洛芬丙酯的化学合成方法
• 2.2.5.3 酶粉的制备
• 2.2.5.4 转化率和对映体选择率的计算方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 HPLC分析方法的建立
• 2.3.2 适用布洛芬拆分的脂肪酶的筛选
• 2.4 小结
• 第3章 游离酶拆分布洛芬的条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 脂肪酶催化酯化拆分反应
• 3.2.3.2 HPLC分析条件
• 3.2.3.3 转化率和对映体选择率的计算方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 水含量对布洛芬酯化拆分的影响
• 3.3.2 温度对布洛芬酯化拆分的影响
• 3.3.3 有机溶剂对布洛芬酯化拆分的影响
• 3.3.4 酶量与水量比例对布洛芬酯化拆分的影响
• 3.3.5 底物醇对布洛芬酯化拆分的影响
• 3.3.6 正丙醇浓度对酯化拆分布洛芬的影响
• 3.3.7 游离脂肪酶催化布洛芬酯化拆分的时间曲线
• 3.4 小结
• 第4章 脂肪酶的固定化及其拆分布洛芬的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 实验仪器
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.4.1 载体的预处理
• 4.2.4.2 脂肪酶的吸附固定化
• 4.2.4.3 固定化脂肪酶催化布洛芬的酯化反应
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 脂肪酶固定化方法的优化
• 4.3.1.1 固定化载体的筛选
• 4.3.1.2 正交实验
• 4.3.1.3 酶粉与树脂比例的影响
• 4.3.1.4 吸附时间的影响
• 4.3.1.5 pH值对固定化脂肪酶活性的影响
• 4.3.1.6 冻干时间的影响
• 4.3.2 固定化脂肪酶拆分布洛芬的条件优化
• 4.3.2.1 摇床转速对布洛芬拆分的影响
• 4.3.2.2 温度对布洛芬拆分的影响
• 4.3.2.3 固定化酶的操作稳定性
• 4.3.2.4 均匀实验
• 4.3.2.5 脂肪酶催化消旋布洛芬拆分的时间曲线
• 4.3.3 几种脂肪酶拆分（R，S）-布洛芬的比较
• 4.4 本章小结
• 第5章 固定化脂肪酶催化布洛芬酯化反应动力学
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料和方法
• 5.2.1 实验试剂
• 5.2.2 实验仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 反应机制
• 5.3.2 非线形拟合与分析
• 5.3.2.1 方程的建立
• 5.3.2.2 非线性拟合
• 5.4 小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 创新点
• 6.2 总结
• 6.3 展望
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历