C2C12细胞中FHL3对不同肌纤维类型MyHC基因表达的影响

论文摘要

肌纤维类型在决定肌肉生长和肉质方面起着重要作用,不同纤维类型肌球蛋白重链(MyHC)基因,如MyHC slow.MyHC 2a.MyHC 2x和MyHC 2b,是目前公认的区分不同肌肉纤维类型的分子标记,因此发现调控不同肌纤维类型MyHC基因表达的基因及其分子机制,对提高瘦肉产量和品质具有重要意义。FHL3蛋白属于LIM超家族,可通过与MyoD.CREB等重要蛋白相互作用参与调节肌细胞分化、细胞骨架形成以及下游基因表达。但有关FHL3是否调控MyHC基因表达尚不清楚。本研究以小鼠C2C12成肌细胞为模型,研究干涉FHL3基因后不同纤维类型MyHCmRNA水平上的表达变化。具体结果如下：1、通过荧光实时定量PCR和Western Blotting技术研究了FHL3基因和MyHCl、2a、2x和2b基因在细胞分化0h、48h、96h和144h的变化情况：在成肌细胞向肌管分化过程中,FHL3基因表达量逐渐减少,而MyHC slow基因在肌管形成初期表达量急剧增加,肌管完全形成后又有所下降；MyHC 2a基因随着细胞的分化表达量逐步增加,在肌管形成后表达量最高；MyHC 2b和MyHC 2x基因也是随着细胞的分化表达量增加,但分化前期变化较小,到肌管基本形成时期表达量陡增。2、利用siRNA小片段进行干扰试验,筛选出其中的siRNAs#3对FHL3的干涉效果较好。并用siRNA #3转染C2C12细胞,转染24h后分化24h、48h、72h,结果分化24h和48h细胞的FHL3相对表达量显著降低。3、利用siRNA #3转染C2C12细胞,转染24h后分化72h,结果显示MyHC slow和MyHC 2a的表达量显著降低,MyHC 2x的表达却显著升高而MyHC 2b的表达无显著性变化。而用siRNA #3转染C2C12细胞,转染48h后分化48h,结果MyHC show表达量显著降低,MyHC 2b和MyHC 2x的表达量显著增加,而MyHC 2a表达降低不明显。比较以上结果发现,其中MyHC slow和MyHC 2x在两种处理的表达变化较一致。4、利用siRNA#3转染分别分化24h、48h和72h的C2C12细胞,转染后继续分化48h,结果分化24h和48h细胞的FHL3的表达量分别显著和极显著降低,对应的MyHC slow和MyHC 2a的表达量也均显著和极显著降低。与以上结果比较发现,MyHC slow的表达量均随FHL3表达的降低而降低。本试验结果显示在C2C12细胞中降低FHL3对MyHC基因有显著的影响,FHL3对MyHC 2b和MyHC 2x有负调节作用,对MyHC slow和MyHC 2a有正调节作用。本研究为进一步阐述FHL3如何调节MyHC基因的表达提供了重要的线索,其作用机理还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 骨骼肌肌纤维的类型及其特征,肌纤维与肉质的关系
• 1.1 骨骼肌肌纤维的类型及其特征
• 1.2 不同肌纤维类型与肉质的关系
• 2 肌纤维类型转化信号通路相关研究进展
• 2.1 胰岛素样生长因子（IGFs）通路
• 2.2 CaN-NFAT信号通路
• 2.3 肌肉发生调控因子（myogenic regulatory factors,MRFs）调控途径
• 3 FHL3家族的研究进展
• 3.1 LIM蛋白的特征、分类及其功能
• 3.2 FHL家族成员及特点
• 3.3 FHL3的结构特点和功能
• 4 RNA干涉技术
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验样品
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.4 常用试剂及其配制
• 2 试验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 FHL3 siRNA表达载体的构建
• 2.2.1 FHL3 siRNAs的设计和合成
• 2.2.2 FHL3 RNAi表达载体的构建
• 2.2.3 FHL3 RNAi表达载体的鉴定和提取
• 2.2.4 超纯质粒的提取
• 2.3 化学合成FHL3-siRNA小片段的设计
• 2.4 脂质体介导的细胞转染（6孔板）
• 2.5 细胞RNA的提取和cDNA的制备
• 2.5.1 细胞RNA的提取
• 2.5.2 RNA的检测
• 2.5.3 反转录反应
• 2.6 FHL3及MyHC各亚型基因的表达分析
• 2.6.1 Real-time PCR的引物设计
• 2.6.2 荧光实时定量PCR
• 2.6.3 定量数据分析
• 2.7 western blot分析
• 2.7.1 蛋白的提取
• 2.7.2 SDS-PAGE电泳
• 2.7.3 转膜
• 2.7.4 免疫反应
• 2.7.5 ECL化学发光检测
• 第四章 结果与分析
• 1 C2C12细胞分化
• 2 小鼠C2C12细胞总RNA的提取和反转录
• 3 分化不同时期的细胞
• 3.1 目的基因FHL3、MyoD和MyHC各亚型基因在细胞分化不同时期的相对表达量
• 3.2 目的蛋白FHL3在细胞分化不同时期的表达变化
• 4 FHL3基因的干扰分析
• 4.1 FHL3 siRNA表达载体的酶切鉴定
• 4.2 FHL3 siRNA表达载体的转染效果
• 4.3 荧光标记的化学合成FHL3-siRNA小片段的转染效果
• 4.4 小干扰RNA片段对目的基因FHL3的影响
• 4.5 siRNA#3转染48h后分化不同时间段细胞FHL3 mRNA水平的变化
• 4.6 siRNA#3转染48h后分化不同时间段细胞FHL3蛋白水平的变化
• 4.7 siRNAs#3转染后分化细胞的MyHC各亚型基因mRNA水平的变化
• 4.8 分化不同时间段后转染siRNA#3细胞的FHL3和MyHC基因的变化
• 第五章 讨论
• 1 RNA干涉的效率
• 1.1 siRNA片段设计技巧
• 1.2 如何提高siRNAs的转染效率
• 2 FHL3在C2C12细胞分化过程中表达量的变化及其与对MYHC基因表达的影响
• 3 本实验在转染时间上的选择
• 4 下一步工作
• 小结
• 参考文献
• 致谢