冬小麦灌浆期高温胁迫差异表达基因的分离

论文摘要

改良小麦品质性状的稳定性，培育适应性强的高产优质品种是小麦育种的重要目标。灌浆期高温胁迫是影响品质稳定性的重要环境因素，严重影响小麦产量和品质，已成为我国北方小麦优质高产的主要生理障碍。目前国内外对小麦灌浆期高温胁迫的研究多集中于产量和品质、生理生化等方面，在基因表达水平研究还不够深入，特别是对高温胁迫下籽粒基因表达模式还缺乏认识，影响了品质稳定性的遗传改良。研究高温胁迫对小麦基因表达的影响对优质小麦品种选育具有重要意义。本研究选用品质相对不稳定的小麦品种济南17和品质较稳定的品种豫麦34，2004年冬种植在温室，开花后15～18天（灌浆中期）及30～33天（灌浆后期）用人工气候室分别进行连续三天的高温胁迫处理（日温38℃、夜温25℃）。取小麦穗部中间2～3个小穗的籽粒，用冷酚法与Trizol一步法相结合的技术提取籽粒总RNA，反转录合成cDNA，通过cDNA-AFLP分析获得差异条带。济南17、豫麦34分别回收410和316个差异条带，再经过克隆、测序、BLAST比对，分别获得85个和99个高温胁迫下差异表达基因片段的序列。经过反向Northern杂交验证后，济南17获得25个信号明显的序列，其中22个来自热诱导表达的基因，主要与小麦的胁迫响应基因、热激蛋白等同源；豫麦34获得31个信号明显的序列，其中25个来自热抑制表达的基因，主要与乙烯合成酶、吡咯琳-5-羧酸合成酶等同源。说明高温胁迫总体上诱导品质不稳定品种的基因表达，而抑制品质稳定品种的基因表达。两个品种各有1个热诱导表达的与贮藏蛋白基因高度同源序列，说明高温胁迫诱导了贮藏蛋白基因表达。济南17的序列有15个来自灌浆中期样本、10个来自灌浆后期样本，豫麦34的序列则分别有29个来自灌浆中期样本、2个来自灌浆后期样本，说明高温胁迫对灌浆中期基因表达的影响要比灌浆后期显著，在品质稳定品种中则比品质不稳定品种更为明显。两个品种在高温胁迫下的基因表达模式存在显著差异，济南17诱导表达胁迫响应基因，豫麦34抑制表达乙烯合成酶和吡咯琳-5-羧酸合成酶及胁迫响应基因，这可能是二者品质稳定性不同的重要原因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 目录
• 第一部分 引言
• 1 小麦灌浆期高温胁迫研究进展
• 1.1 产量和品质
• 1.2 生理生化
• 1.3 热激蛋白
• 1.4 耐热性
• 1.5 基因表达
• 1.6 蛋白质组学
• 2 基因差异表达的研究方法
• 2.1 mRNA差异显示技术
• 2.2 代表性差异分析和cDNA代表性差异分析
• 2.3 抑制消减杂交
• 2.4 基因表达系列分析
• 2.5 cDNA-AFLP
• 2.6 cDNA微阵列
• 2.7 双向电泳技术
• 2.8 噬菌体表面全套抗体库技术
• 3 本研究的目的和意义
• 3.1 研究目的
• 3.2 研究意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 小麦品种
• 1.2 菌种及培养基
• 1.3 缓冲液、提取缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶储存液
• 1.4 工具酶
• 1.5 试剂盒及试剂
• 1.6 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 材料种植和高温胁迫处理
• 2.2 RNA的提取和纯化
• 2.3 cDNA的合成及纯化
• 2.4 cDNA-AFLP分析
• 2.5 差异片段的回收、再扩增和纯化
• 2.6 差异片段的克隆和鉴定
• 2.7 序列分析
• 2.8 阳性克隆的反向 Northern杂交鉴定
• 第三部分 结果与分析
• 1 小麦籽粒总 RNA的提取
• 1.1 总 RNA琼脂糖胶电泳检测
• 1.2 纯化总 RNA琼脂糖胶电泳检测
• 1.3 纯化总 RNA紫外分光光度计检测结果
• 1.4 -80℃冰箱放置十个月纯化总 RNA琼脂糖电泳检测
• 2 cDNA-AFLP分析
• 2.1 cDNA琼脂糖胶电泳检测
• 2.2 cDNA-AFLP分析
• 3 差异片段的再扩增和纯化
• 3.1 差异片段的再扩增
• 3.2 差异片段再扩增产物的纯化
• 4 差异片段的克隆和序列分析
• 4.1 差异片段阳性克隆的菌液 PCR验证
• 4.2 阳性片段的序列分析
• 5 反向 Northern杂交分析
• 第四部分 讨论
• 1 高质量的小麦种子总 RNA的快速提取
• 2 小麦灌浆期高温胁迫下基因差异表达与品质稳定性
• 第五部分 总结
• 1 本研究主要获得的结果
• 1.1 总 RNA提取
• 1.2 灌浆期高温胁迫下基因差异表达与品质稳定性
• 2 本研究的创新之处
• 2.1 设计创新
• 2.2 材料创新
• 2.3 方法创新
• 3 需进一步研究的问题
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文目录