杜氏盐藻耐盐渗透调节与Ca2+介导的渗透信号传导

论文摘要

杜氏盐藻是杜氏藻中的一种,它能够在大约0.05 mol/L到饱和（5.5 mol/L左右）NaCl浓度的广泛盐度范围内生长。甘油是杜氏盐藻在不同的盐度环境中生存的重要渗透物质,甘油的合成牵涉到两种特殊的酶,NAD+为辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶（G3PDH）和3-磷酸甘油磷酸酶（G3PP）,而相反的途径甘油的异化牵涉到NADPH为辅酶的二羟基丙酮还原酶（DHAR）和一种二羟基丙酮激酶（DHAK）。Ca2+是细胞内普遍存在的第二信使,在由细胞表面的环境刺激而引起的渗透信号的传导过程中起作用。本论文中,为了研究盐胁迫下杜氏盐藻的渗透响应过程,本人检测了杜氏盐藻在不同盐胁迫条件下细胞生长、细胞形态、胞内甘油含量和甘油代谢途径中4种酶活性的变化情况。使用同工酶电泳技术鉴定不同盐度下NAD+为辅酶的G3PDH的同工酶活性,并从盐藻中克隆出一种全长为2100 bp的以NAD+为辅酶的G3PDH的cDNA序列,使用实时定量PCR技术检测盐度变化对该基因表达的影响。另外,使用激光共聚焦扫描显微镜和药理学方法检测Ca2+通道阻滞剂对盐藻细胞质中Ca2+浓度水平的影响和Ca2+在低渗、高渗胁迫下盐藻细胞内甘油代谢和G3PDH活性调控过程中的作用。实验结果显示杜氏盐藻的最适生长盐度为2.0 mol/L NaCl,在不同盐度长期培养下杜氏盐藻细胞形态和体积变化较小,但当盐度突然改变时,细胞形态和体积发生显著变化,除高盐胁迫之外这些细胞形态和体积的显著变化会在2小时后基本恢复。并且,当盐度从2.0 mol/L NaCl快速升高到4.0-5.0 mol/L NaCl时,在盐藻细胞表面发现一些脂质小泡出现。当盐藻在不同盐度下长期培养时,单细胞甘油含量的积累随盐度增加而升高,并且盐藻还能够快速降低或升高细胞甘油含量来适应低渗或高渗胁迫。甘油的代谢途径中,实验中4种酶都受长期高盐胁迫的刺激,但在低渗和高渗胁迫下,只有G3PDH的活性与盐度显著相关。同工酶电泳检测中,G3PDH和SOD这两类同工酶可以同时检测出来。值得注意的是,第一次鉴定出杜氏盐藻中五种G3PDH的同工酶,这些同工酶分别在不同的盐度下起作用。不同盐度长期培养下盐藻中一种G3PDH的基因表达水平与培养盐度显著负相关,但低渗或高渗胁迫处理2小时后该基因表达水平却与处理盐度没有显著性关系。另外,当胞外盐度突然降低或升高时盐藻胞内Ca2+浓度会迅速升高,但使用三种Ca2+通道阻滞剂预处理能够抑制Ca2+的升高,而阻滞剂维拉帕米（VP）可能也会抑制Ca2+从细胞质中的排出。使用Ca2+通道阻滞剂对盐藻预处理也会抑制盐藻应对低渗或高渗胁迫时甘油含量和G3PDH活性的变化。因此,本论文的实验结果说明杜氏盐藻的渗透响应过程包括细胞形态、胞内甘油含量、甘油代谢相关酶活性和基因表达的变化在渗透调节中起重要作用使盐藻能够在多种盐度下生存。此外,Ca2+从胞外环境或胞内钙库流入细胞质是渗透信号传导调控盐藻渗透响应过程所需要的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 植物对环境盐分胁迫的渗透调节
• 1.1.1 盐胁迫及植物的主要耐盐机制
• 1.1.2 渗透调节机制
• 1.1.3 有机溶质
• 1.1.4 无机离子
• 1.1.5 不同渗透物的相互作用
• 1.1.6 提高植物耐盐能力的方法
• 1.2 杜氏藻对盐分变化的渗透响应
• 1.2.1 杜氏藻
• 1.2.2 杜氏藻的耐盐渗透调节
• 1.2.3 耐盐渗透信号传导机制
• 1.2.4 杜氏盐藻耐盐机制研究中分子生物学技术的应用
• 1.3 本论文的研究内容、目的和意义
• 第二章 盐度变化对杜氏盐藻生长、细胞形态及甘油含量的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 藻种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 生化试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 杜氏盐藻的梯度盐度培养
• 2.2.6 低渗和高渗胁迫处理
• 2.2.7 甘油含量的检测
• 2.2.8 统计分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 梯度盐度下杜氏盐藻的生长曲线
• 2.3.2 细胞形态变化
• 2.3.3 甘油含量的检测
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 盐度变化对盐藻甘油合成途径中四种酶活性的影响及3-磷酸甘油脱氢酶同工酶电泳分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 生化试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 杜氏盐藻的梯度盐度培养
• 3.2.4 低渗和高渗盐胁迫处理
• 3.2.5 粗酶液的提取
• 3.2.6 蛋白浓度的测定
• +为辅酶的G3PDH 活性测定'>3.2.7 NAD⁺为辅酶的G3PDH 活性测定
• 3.2.8 G3PP 活性测定
• 3.2.9 DHAR 活性的测定
• 3.2.10 DHAK 活性的测定
• 3.2.11 G3PDH 的同工酶电泳分析
• 3.2.12 统计分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 G3PDH 活性的检测
• 3.3.2 G3PP 活性的检测
• 3.3.3 DHAR 活性的检测
• 3.3.4 DHAK 活性的检测
• 3.3.5 G3PDH 同工酶电泳
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• +为辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶基因表达水平的影响'>第四章 盐度变化对杜氏盐藻中一种以 NAD⁺为辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶基因表达水平的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 质粒、菌种及培养基
• 4.2.2 生化试剂及试剂盒
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 杜氏盐藻的培养
• 4.2.5 杜氏盐藻总RNA 的提取及检测
• 4.2.6 RT-PCR
• 4.2.7 盐藻G3PDH 基因保守片段的扩增
• 4.2.8 通过染色体步移PCR 获得盐藻G3PDH 基因的cDNA 序列
• 4.2.9 DNA 片段的回收
• 4.2.10 感受态细胞的制备、转化和筛选
• 4.2.11 G3PDH 基因cDNA 及蛋白质的生物信息学分析
• 4.2.12 G3PDH 基因ORF 扩增引物的设计及ORF 序列的扩增
• 4.2.13 质粒的提取
• 4.2.14 G3PDH 原核表达载体的构建及转化
• 4.2.15 G3PDH 基因表达蛋白的SDS-PAGE 检测
• 4.2.16 杜氏盐藻的梯度盐度培养
• 4.2.17 低渗和高渗胁迫处理
• 4.2.18 杜氏盐藻总RNA 的提取
• 4.2.19 逆转录
• 4.2.20 实时定量PCR
• 4.2.21 统计分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 杜氏盐藻G3PDH 基因cDNA 的克隆
• 4.3.2 杜氏盐藻G3PDH 基因cDNA 及蛋白质的生物信息学分析
• 4.3.3 杜氏盐藻G3PDH 基因的酶切位点分析
• 4.3.4 杜氏盐藻G3PDH ORF 的扩增
• 4.3.5 原核表达载体pET-32a-G3PDH 的构建和转化
• 4.3.6 SDS-PAGE 电泳检测G3PDH 重组蛋白表达
• 4.3.7 杜氏盐藻G3PDH 基因的实时定量RT-PCR 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 2+介导的渗透信号传导对胞内甘油水平和3-磷酸甘油脱氢酶活性的调节作用'>第五章 杜氏盐藻中Ca²⁺介导的渗透信号传导对胞内甘油水平和3-磷酸甘油脱氢酶活性的调节作用
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 生化试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 杜氏盐藻的培养
• 2+荧光指示剂探针孵育'>5.2.4 Ca²⁺荧光指示剂探针孵育
• 2+通道阻滞剂预处理'>5.2.5 Ca²⁺通道阻滞剂预处理
• 5.2.6 渗透胁迫处理
• 2+荧光扫描'>5.2.7 Ca²⁺荧光扫描
• 2+通道阻滞剂处理及渗透胁迫后细胞内甘油含量的检测'>5.2.8 Ca²⁺通道阻滞剂处理及渗透胁迫后细胞内甘油含量的检测
• 2+通道阻滞剂处理及渗透胁迫后细胞内G3PDH 活性的测定'>5.2.9 Ca²⁺通道阻滞剂处理及渗透胁迫后细胞内G3PDH 活性的测定
• 5.2.10 统计分析
• 5.3 实验结果
• 2+浓度变化'>5.3.1 Ca²⁺浓度变化
• 5.3.2 甘油含量变化
• 5.3.3 G3PDH 活性变化
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附录