关节腔注射低分子肝素与玻璃酸钠复方凝胶注射液治疗骨关节炎的研究

论文摘要

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一组有不同病因但有相似生物学、形态学和临床表现的疾病,其发病机制尚不明确,是一个非常复杂的过程,系多因素相互作用的结果,与年龄、肥胖、炎症、遗传、内分泌异常、气候等因素有关。随着社会人口老龄化的加快,OA的危害越来越大。我国约有6 000万～7 000万人患有不同程度的OA。低分子肝素（low molecular weight heparin,LMWH）是糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）中结构较为复杂的一种。最新研究表明,LMWH不仅具有抗凝、抗血栓、调血脂等多种生物活性,同时还有改善局部血液循环,加速创面愈合,促进结缔组织修复、抗炎、消肿、抗过敏等功效。玻璃酸钠（sodium hyaluronate,SH）是关节滑液及软骨的重要组成成分,广泛存在于软骨多形细胞、滑膜细胞中,对关节、软骨起润滑、缓冲和屏障作用,组成和修复关节软骨。关节腔注射SH已成为OA的主要治疗方法,其能够增加关节滑液的黏弹性和润滑性,较好的改善OA,恢复滑膜和软骨基质的黏弹性,缓解炎症等。本课题研究了LMWH与SH（LMWH-SH）复方凝胶注射液、LMWH注射液及其对OA动物模型的治疗作用和机制。研究中取得了以下几方面的成果。1制备了LMWH-SH、LMWH注射液研究制备了一定浓度的LMWH-SH复方凝胶注射液和LMWH注射液。建立了LMWH-SH复方凝胶注射液的主要质量控制指标,并进行了稳定性考察,表明该复方凝胶注射液具有良好的稳定性。2考察了LMWH-SH、LMWH注射液对OA动物模型的治疗作用建立了木瓜酶诱导的兔膝OA动物模型,以不同浓度的LMWH-SH、LMWH注射液进行兔膝关节腔注射,以生理盐水（normal saline,NS）和SH注射液为对照,给药5周,取关节软骨进行光镜观察,观察关节软骨和滑膜变化情况。结果发现,LMWH-SH各复方制剂均能显著减轻兔膝OA症状。3进行了LMWH-SH复方凝胶注射液的剂量筛选实验根据动物预试实验结果,结合制剂的理化性质,确定LMWH与SH的最佳配比。按照预试动物实验方法,进行剂量筛选实验。4研究了LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的作用机制通过碱水解、蛋白酶裂解、超速离心的方法提取分离经LMWH-SH等注射液治疗的OA模型兔膝关节软骨的GAG,用天青A（Azure A,AA）比色法检测GAG总量,用放射免疫法测定其中玻璃酸（hyaluronic acid,HA）的含量,考察治疗后关节软骨基质蛋白聚糖（proteoglycan,PG）的变化。结果发现LMWH-SH复方凝胶注射液能够明显增加病变关节软骨中PG的含量。研究还检测了治疗后OA模型兔膝关节滑液中白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）的表达水平,发现LMWH-SH复方凝胶注射液能够显著降低关节滑液中IL-1β、TNF-α的表达水平。由于IL-6具有双重作用,很难用其表达水平来考察OA的严重程度。综合病理切片、细胞因子（cytokine,CK）水平的考察结果,LMWH-SH复方凝胶注射液的治疗效果较好。根据研究结果推测,复方凝胶注射液组中低LMWH-SH组治疗效果更佳。研究中取得的主要研究成果和结论:（1）研究探讨了LMWH-SH、LMWH注射液的制备工艺和生产条件。（2）研究了质量可控,具有良好稳定性的LMWH-SH复方凝胶注射液。（3）LMWH-SH注射液的流变学性质与文献报道的正常关节滑液的流变学性质类似,因此可以作为人工滑液。（4）考察了不同浓度木瓜酶诱导的兔OA模型的严重程度和适用性。（5）用木瓜酶诱导的兔OA模型考察3种不同配比的LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的疗效,研究证实LMWH-SH复方凝胶注射液能够保护关节软骨,显著改善兔膝OA,减轻炎症反应。（6）从免疫分子水平探讨了LMWH-SH复方凝胶注射液对OA的作用机制,发现LMWH-SH复方凝胶注射液可显著降低OA模型兔膝关节滑液中IL-1β和TNF-α的表达水平,从而对软骨PG的降解起到延缓作用,其作用效果较佳。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 1 OA治疗的研究进展
• 1.1 OA的定义、分类、发病机制与病理改变
• 1.2 OA的流行病学研究
• 1.3 OA的治疗药物
• 1.3.1 NSAID
• 1.3.2 皮质激素
• 1.3.3 黏弹性补充药物
• 1.3.4 补充软骨基质成分
• 1.3.5 其他
• 2 LMWH与OA
• 2.1 LMWH简介
• 2.2 LMWH在OA治疗中的作用
• 3 SH与OA
• 3.1 SH简介
• 3.2 SH在OA治疗中的作用
• 4 LMWH-SH复方凝胶注射液与OA
• 5 本课题的研究目的和研究内容
• 5.1 研究目的
• 5.2 研究内容
• 第一章 LMWH-SH复方凝胶注射液的制备及动物OA模型的建立
• 1 动物造模
• 1.1 关节制动
• 1.2 手术方法
• 1.3 关节腔注射
• 2 实验仪器与材料
• 2.1 仪器
• 2.2 原料与试剂
• 3 注射液的制备
• 3.1 不同注射液的配制
• 3.1.1 不同组别的氯化钠含量
• 3.1.2 不同注射液制备工艺
• 3.1.3 灌装
• 3.2 LMWH-SH复方凝胶注射液有关指标的检测
• 3.2.1 特性黏数测定
• 3.2.2 pH值测定
• 3.2.3 稳定性考察
• 3.3 LMWH-SH复方凝胶注射液有关指标检测结果
• 4 动物模型
• 4.1 动物预试实验模型建立
• 4.2 动物给药
• 5 讨论
• 第二章 LMWH-SH复方凝胶注射液治疗OA的疗效考察
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 仪器
• 1.4 研究材料取材
• 2 方法
• 2.1 关节软骨GAG与HA含量测定
• 2.1.1 关节软骨中GAG的提取
• 2.1.2 总GAG含量测定
• 2.1.2.1 标准曲线的绘制
• 2.1.2.2 样品中总GAG含量测定
• 2.1.3 HA含量测定
• 2.1.3.1 原理
• 2.1.3.2 操作步骤
• 2.1.3.3 数据处理
• 2.2 关节滑液中CK的测定
• 2.2.1 IL-1β的含量测定
• 2.2.2 TNF-α与IL-6的含量测定
• 2.2.3 统计学方法
• 2.3 关节滑膜、软骨病理切片
• 3 结果
• 3.1 各组动物软骨中GAG与HA含量
• 3.1.1 各组动物软骨中GAG含量
• 3.1.1.1 GAG标准曲线的测定
• 3.1.1.2 软骨样本中GAG的含量
• 3.1.2 各组动物关节软骨中HA的含量
• 3.1.2.1 HA标准曲线的测定
• 3.1.2.2 软骨样本中HA的含量
• 3.2 各组动物关节滑液中CK的表达水平
• 3.2.1 IL-1β在各组动物中的表达水平
• 3.2.1.1 IL-1β标准曲线的测定
• 3.2.1.2 IL-1β表达水平
• 3.2.2 TNF-α在各组动物中的表达水平
• 3.2.2.1 TNF-α标准曲线的测定
• 3.2.2.2 TNF-α表达水平
• 3.2.3 IL-6在各组动物中的表达水平
• 3.2.3.1 IL-6标准曲线的测定
• 3.2.3.2 IL-6表达水平
• 3.3 关节滑膜、软骨病理切片观察
• 3.3.1 关节滑膜常规HE染色病理切片
• 3.3.2 关节软骨常规HE染色病理切片
• 3.3.3 关节软骨AB-PAS染色病理切片
• 4 讨论
• 4.1 各组对关节滑液中IL-1β、TNF-α和IL-6的作用
• 4.2 各组对关节滑膜和软骨的作用
• 4.3 各组治疗OA的疗效评价
• 第三章 LMWH-SH复方凝胶注射液剂量筛选及其治疗OA作用机制的研究
• 1 材料
• 1.1 动物
• 1.2 动物饮食
• 1.3 实验药物
• 2 方法
• 2.1 关节软骨GAG与HA含量测定
• 2.2 关节滑液中CK的测定
• 2.3 关节滑膜、软骨病理切片
• 3 结果
• 3.1 各组动物软骨中GAG与HA含量
• 3.1.1 各组动物软骨中GAG含量
• 3.1.1.1 GAG吸收光谱曲线和测定波长的确定
• 3.1.1.2 GAG标准曲线的测定
• 3.1.1.3 软骨样本中GAG的含量
• 3.1.2 各组动物关节软骨中HA的含量
• 3.1.2.1 HA标准曲线的测定
• 3.1.2.2 软骨样本中HA的含量
• 3.2 各组动物关节滑液中CK的表达水平
• 3.2.1 IL-1β在各组动物中的表达水平
• 3.2.1.1 IL-1β标准曲线的测定
• 3.2.1.2 IL-1β表达水平
• 3.2.2 TNF-α在各组动物中的表达水平
• 3.2.2.1 TNF-α标准曲线的测定
• 3.2.2.2 TNF-α表达水平
• 3.2.3 IL-6在各组动物中的表达水平
• 3.2.3.1 IL-6标准曲线的测定
• 3.2.3.2 IL-6表达水平
• 3.3 关节滑液、软骨病理切片观察
• 3.3.1 光镜观察评分
• 3.3.2 关节滑膜常规HE染色病理切片
• 3.3.3 关节软骨常规HE染色病理切片
• 3.3.4 关节软骨AB-PAS染色病理切片
• 4 讨论
• 4.1 LMWH-SH复方凝胶注射液对关节软骨基质PG的影响
• 4.2 关节滑液中炎性CK与OA发病的机制
• 第四章 总结与展望
• 1 总结
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表