胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化

论文摘要

目的:1.体外探讨分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的方法,并观察其体外的多向分化与增殖能力以及其生物学特性,还对细胞表面干细胞相关标志物进行鉴定,为骨髓间充质干细胞的进一步研究奠定基础。2.探讨胰岛素样生长因子和多种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的可行性,实验条件。并用激光共聚焦显微镜观察分化细胞的阳性率,及形态学变化寻找最佳的诱导条件,为获得大量少突胶质细胞移植修复脊髓损伤奠定基础。3.在实验二的基础上,观察骨髓间充质干细胞的增殖分化过程,判断IGF-1在少突胶质细胞分化中的那个环节起作用,寻找胰岛素样生长因子和多种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的作用机制,并给予一定的干预措施,进一步予以证实。方法:1.取原代细胞后,用贴壁筛选法和胰蛋白酶消化法分离纯化,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长特征,研究其增殖过程,绘制出生长曲线,采用免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定,对第4代细胞分别用成骨,成软骨,成脂肪和成神经诱导剂培养,行碱性磷酸酶染色,Van kossa银染色法,Ⅱ型胶原免疫组化染色,油红O染色,NeuN抗体免疫组化染色以及形态学观察,证实其干细胞的多向分化潜能。2.选取生长良好的第4代骨髓间充质干细胞,胰酶消化后,离心加入诱导液,转移至含有盖玻片的培养皿中,细胞数为1×104个/cm2,放入体积分数为0.05的CO2孵箱中培养48h后,诱导组细胞更换培养液,用含不同浓度IGF-1的分化培养液培养3d后,观察骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白（MBP）、半乳糖脑苷脂（Glac）、半定量RT-PCR（semi-quatitative reverse transctiption-polymerase chain reaction）检测,Western-blot测定大鼠磷脂碱性蛋白（MBP）含量,免疫细胞化学染色后激光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的阳性率。并筛选出最佳IGF-1（Insulin growthfactor-1）浓度剂量的分化培养液。3.根据BMP2（bone morphogenetic proteins）在少突胶质细胞的形成中起抑制作用,少突胶质细胞的成熟需要BMP信号的抑制剂,为了获得IGF—1诱导少突胶质细胞分化的分子机制,我们推断IGF—1的影响是通过抑制BMP2信号通路。我将分化培养液中加入不同剂量的BMP2培养3天,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白（MBP）、半乳糖脑苷脂（Glac）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白—2 （MAP-2）半定量RT-PCR检测,并进行统计学处理,免疫细胞化学染色后激光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的阳性细胞百分比。结果:1.所分离培养的细胞形态呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31小时,经成骨诱导剂诱导培养2周后,碱性磷酸酶染色成阳性,Van kossa银染色法阳性表明该细胞可向成骨方向分化,经成软骨诱导剂诱导培养2周后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明该细胞可向成软骨方向分化,而分离培养的细胞经成脂肪诱导剂诱导培养2周后,油红O染色可见显微镜下大量细胞内充满红色脂肪滴,表明该细胞可向脂肪细胞方向分化,所培养的细胞经化学性神经诱导剂诱导培养8小时后,NeuN抗体免疫组化染色阳性,细胞呈神经元样形态表现,表明该细胞可向神经细胞方向分化。MSCs抗原CD34免疫细胞化学染色呈阴性反应,CD44免疫细胞化学染色见镜下有棕黄色颗粒沉积。以上结果提示,用贴壁筛选法所分离培养的细胞为具有多向分化潜能的大鼠骨髓间充质干细胞。2.①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%。比较含不同IGF-1浓度的分化培养液,发现含500μg/L IGF-1浓度的培养液少突胶质细胞标志物阳性率最高。④Western-blot检测磷脂碱性蛋白表达水平明显增高,以含500μg/L IGF-1浓度的培养液分化组最为明显。3.在分化培养液中加入不同浓度的BMP2,发现向少突胶质细胞的分化明显受到抑制,仅部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,与BMP2的浓度成依赖关系,浓度越高（5μg/L）少突胶质细胞标志物（Glac,MBP）的阳性细胞越少,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白（MBP）、半乳糖脑苷脂（Glac）半定量RT-PCR检测,未检查出特异性条带。在低浓度（0.05μg/L—0.5μg/L）的情况下,可以观察到部份细胞向少突胶质细胞分化,这个结果与BMPs抑制少突胶质分化的特性相一致。结论:1.通过取大鼠骨髓组织培养,用贴壁筛选法和胰蛋白酶消化法分离纯化,可以分离出稳定的含CD44抗原的有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞,该细胞不断可以向中胚层成细胞分化,而且可以向外胚层神经细胞分化,取材方便,容易获得是体外研究干细胞定向分化的理想细胞。2.合适的培养基和一定浓度的IGF-1有利于骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化,该结果通过探讨诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的可行性,实验条件,为以后的间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化移植治疗脊髓损伤打下基础。3.胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化,其主要作用机理是通过抑制少突胶质细胞前体在脊髓中特异化的抑制性因子BMPs的信号通道,促进少突胶质细胞的产生。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 正文:胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化
• 引言
• 第一部分 体外培养的大鼠骨髓MSCs的鉴定及多向分化研究
• 中文摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 多种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化
• 摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 IGF-1诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的分子机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结与展望
• 附录
• 关节镜下自体骨软骨移植修复软骨缺损的临床研究
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 主要英文缩略词
• 致谢