食品中动物源性成分定性鉴定方法研究

论文摘要

本研究采用高度特异引物PCR法、基因条形编码法（DNA barcoding）、限制性内切酶酶切片段长度多态性法（PCR-RFLP）、通用引物-聚合酶链式反应-限制性片段末端长度多态性法（UP-PCR-TRFLP）对食品中猪、牛、羊源性成分进行检测,比较四种方法各自的优缺点及适用范围,建立食品中动物源性成分定性鉴定方法。主要研究结果如下:（1）试验证实:基于线粒体DNA（mtDNA）D-loop区和细胞色素b（Cytb）基因设计出的引物具有高度特异性,能够对食品中猪、牛、羊源性成分进行准确的定性检测,且能够检测混合样品。（2）利用双脱氧法sanger法对COⅠ基因测序并对测序结果进行多重序列比对,发现猪、羊、牛COⅠ基因的碱基差异为19%～25.9%,物种内的碱基差异仅为0.1%～1.6%。COⅠ基因含有大量的具有物种特征的单核苷酸位点,因此,利用猪、牛、羊COⅠ基因的碱基差基因条码技术能够非常准确地鉴定食品中的猪、牛、羊3种动物源性成分,但是受sanger法测序技术的限制,该方法不适于混合样本的检测。（3）利用PCR-RFLP法对猪、羊、牛3个物种的COⅠ基因进行酶切,经HinfⅠ酶切后均可获得3个物种特征片段长度段,猪的片段长度分别为40bp、411bp、449 bp;牛分别为46p,377bp,479 bp;羊分别为144bp、376bp381 bp。通过电泳检测, PCR-RFLP法能够对食品中的猪、牛、羊3种动物源性成分进行定性鉴定,但不适于混合样品的检测。（4）采用UP-PCR-TRFLP法在COⅠ基因保守区设计一对牛羊通用引物,并对上游引物的5’端用6-FAM进行荧光标记,在下游引物的5’端用ROX进行荧光标记,然后用限制性内切酶HinfⅠ和BlnⅠ进行酶切消化,再经毛细管电泳建立牛和羊的特有峰谱。牛的PCR产物经过限制性内切酶HinfⅠ酶切后在上游会产生373bp长度的片段,在下游产生46bp长度的片段,这两个片段为牛酶切后的特征片段。羊的PCR产物经过限制性内切酶BlnⅠ酶切后在上游会产生515bp长度的片段,在下游产生203bp长度的片段,这两个片段为羊酶切后的特征片段。不同物种可产生不同的峰谱。因此该法可用于牛、羊肉的定性鉴定分析,且能够用于混合样本的的鉴定。（5）mtDNA上的COⅠ基因测序分析和限制性内切酶切分析结果均表明:COⅠ基因含有大量能够用于物种鉴定的碱基突变,在猪、牛、羊的物种鉴定中,具有很好的区分鉴别能力,可以应用于食品中动物源性成分的鉴定工作。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 食品中动物源性成分鉴定的意义
• 1.1 动物源性食品在消费品中的地位
• 1.2 动物源性成分掺杂掺假现状
• 1.3 动物源性成分鉴定的重要性
• 第二章 动物源性商品材质鉴定方法
• 2.1 感官检验鉴定方法
• 2.2 细胞学鉴定方法
• 2.3 化学鉴定法
• 2.3.1 色谱
• 2.3.2 光谱
• 2.4 蛋白质鉴定方法
• 2.4.1 同工酶分析
• 2.4.2 ELISA 法
• 2.4.3 电泳方法
• 2.4.4 等电子聚焦
• 2.5 分子标记鉴定方法
• 第三章 动物源性商品分子生物学检测方法研究
• 3.1 限制性内切酶酶切片段多态性（PCR-RFLP）
• 3.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 3.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 3.4 测序分析法
• 3.5 基因条码技术
• 3.6 PCR 技术
• 3.6.1 高度特异性引物PCR 鉴定
• 3.6.2 实时荧光定量PCR 鉴定
• 3.7 用于食品中动物源性成分鉴定的基因位点选择
• 3.8 分子生物学方法在动物源性商品材质鉴定中应用前景
• 试验研究
• 前言
• 第四章 物种特异性引物法鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 物种高度特异性引物
• 4.1.3 DNA 浓度和纯度测定
• 4.1.4 PCR 反应体系
• 4.1.5 PCR 反应程序
• 4.1.6 结果检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 基因组DNA 结果凝胶电泳检测
• 4.2.2 猪特异性引物 PCR 扩增检测结果
• 4.2.3 牛特异性引物 PCR 扩增检测结果
• 4.2.4 山羊特异性引物 PCR 扩增检测结果
• 4.2.5 绵羊特异性引物 PCR 扩增检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 基因条形编码法
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 引物
• 5.1.3 PCR 反应体系
• 5.1.4 PCR 反应程序
• 5.1.5 胶回收纯化
• 5.1.6 DNA 序列测定
• 5.1.7 测序结果分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
• 5.2.2 测序法测序结果峰图
• 5.2.3 猪、牛、羊COⅠ基因序列比对结果
• 5.2.4 猪、牛、羊COⅠ基因的碱基差异
• 5.2.5 系统发生分析
• 5.3 讨论
• 第六章 PCR-RFLP 法
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 PCR-RFLP 引物
• 6.1.3 PCR 反应体系
• 6.1.4 PCR 反应程序
• 6.1.5 PCR 反应产物的限制性酶切
• 6.1.6 试验结果检测
• 6.2 PCR-RFLP 法检测试验结果
• 6.2.1 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
• 6.2.2 限制性内切酶酶切结果
• 6.3 讨论
• 第七章 UP-PCR-TRFLP 法
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 荧光标记通用引物
• 7.1.3 UP-PCR-TRFLP 法PCR 反应体系
• 7.1.4 UP-PCR-TRFLP 法PCR 反应程序
• 7.1.5 扩增产物检测及纯化回收
• 7.1.6 PCR 反应产物的限制性酶切
• 7.1.7 毛细管电泳
• 7.1.8 结果分析
• 7.2 结果
• 7.2.1 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳结果
• 7.2.2 牛样品的UP-PCR-TRFLP 法检测结果
• 7.2.3 羊样品的UP-PCR-TRFLP 法检测结果
• 7.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介