卡介菌多糖核酸对鸡胚成纤维细胞和鸡外周血淋巴细胞凋亡作用的研究

论文摘要

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是从卡介菌中经热酚法提取的多糖、核酸的生物活性物质,主要用于预防和治疗慢性支气管炎、感冒等,近年来随着研究的深入,发现它还具有增强免疫力、抗肿瘤等作用,且在临床上被广泛使用。但是BCG-PSN在兽医临床应用上则鲜有报道,尤其是BCG-PSN深层次作用机理的研究更是少见；同时,作为一种多糖与核酸的混合物,BCG-PSN中多糖、核酸的确切成分、两种组份单独的药效情况以及多糖、核酸之间的相互作用均知之甚少,从而严重制约了BCG-PSN在兽医临床上的具体应用。为解决这些问题,我们进行了BCG-PSN提取、组份分离试验,并利用提取的BCG-PSN对体外培养鸡胚成纤维细胞及鸡外周血淋巴细胞诱发的凋亡作用了进行了相关研究。BCG-PSN对离体培养鸡胚成纤维细胞凋亡作用的研究试验采用超声波破碎、热酚处理、透析醇沉的优化方案,从卡介苗中提取得到了纯度较高的卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）,并利用提取得到的BCG-PSN对离体培养的鸡胚成纤维细胞（CEF）进行药物处理,采用MTT检测技术、显微检测技术、流式细胞检测技术、分光光度法检测技术等,就BCG-PSN对离体培养CEF生长的细胞抑制效果、BCG-PSN在不同时间和不同药物浓度下对离体培养CEF的细胞形态、凋亡变化以及由此引发的细胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的动态变化等进行了较为详细的研究。研究结果显示,随着BCG-PSN使用浓度的升高,CEF生长活性呈现出先升高、后降低的现象,说明BCG-PSN作为一种免疫调节剂,适度浓度时可增强细胞活性,而当药物浓度过大时,反而会明显降低细胞活性；CEF活性明显降低的主要表现为CEF出现变形、变圆,细胞核出现深染、边聚等现象,凋亡细胞数目明显增多；凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9的浓度与对照组细胞相比也出现了显著差异,当BCG-PSN浓度过大时,CEF凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-9的浓度反而出现下降,说明过高浓度的BCG-PSN可直接导致CEF的坏死而非以凋亡的方式发生死亡；随着与BCG-PSN作用时间的延长,CEF的活性明显下降,凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-9的浓度也呈现出先升高、后下降的现象,说明可以通过控制BCG-PSN的浓度、增加药物作用的时间而诱导细胞凋亡的发生。BCG-PSN对离体培养鸡外周血淋巴细胞凋亡作用的研究试验采用DEAE-纤维素阴离子柱层析法对自行提取的卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）进行组份分离,得到BCG-PSN、卡介菌多糖（BCG-PSA）与卡介菌核酸（BCG-NA）的粗分离组份,利用BCG-PSN、BCG-PSA及BCG-NA对离体培养的鸡外周血淋巴细胞（PBL）进行药物处理,通过Trypan blue检测技术、流式细胞检测技术、分光光度法检测技术、显微检测技术等,就BCG-PSN、 BCG-PSA及BCG-NA对离体培养PBL的细胞生长抑制效果、不同时间和不同药物浓度对离体培养PBL的细胞凋亡数目及由此引发的细胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的动态变化等进行了较为详细的研究。结果显示,BCG-PSN在低浓度时有增强细胞活性的功效,而当药物浓度过大时,则导致细胞活性明显降低；当BCG-PSN的浓度达到1000μg/mL时,PBL凋亡细胞数目明显增加,凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-9的浓度与空白对照组细胞相比也出现了显著差异。BCG-PSN浓度较低时,有抑制PBL凋亡和坏死的效应,但BCG-PSN浓度过大时,可能直接导致PBL的坏死而非以凋亡的方式发生死亡。单一组份（BCG-PSA、 BCG-NA）对凋亡蛋白的诱导效果不如BCG-PSN,两者在BCG-PSN中可能起到相互协同的效果,且BCG-PSA对凋亡蛋白Caspase的诱导效果略高于BCG-NA;而Caspase-9的变化与Caspase-3的变化较为相似,提示BCG-PSN引起的PBL凋亡现象可能与线粒体途径引起的凋亡相关途径有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 卡介菌多糖核酸及细胞凋亡相关研究
• 1 多糖核酸类药物概述
• 1.1 多糖类药物概述
• 1.2 核酸类药物概述
• 1.3 卡介菌多糖核酸的概述
• 2 细胞凋亡研究进展
• 2.1 细胞凋亡概述
• 2.2 细胞凋亡的主要调控基因
• 2.3 细胞凋亡途径与信号转导
• 2.4 细胞调亡的主要检测方法
• 参考文献
• 第二章 BCG-PSN对离体培养鸡胚成纤维细胞凋亡作用的研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 BCG-PSN的提取
• 2.2 MTT检测法测定BCG-PSN对CEF抑制率的影响
• 2.3 CEF凋亡的形态学变化
• 2.4 流式细胞仪检测CEF凋亡结果
• 2.5 CEF中激活态Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9的变化结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 BCG-PSN对离体培养鸡外周血淋巴细胞凋亡作用的研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 多糖和核酸分离结果
• 2.2 Trypan blue法测定BCG-PSN对PBL存活率的影响
• 2.3 PBL凋亡的形态学变化
• 2.4 流式细胞检测PBL凋亡结果
• 2.5 PBL中激活态Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9的变化情况
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢