高山离子芥低温胁迫调控的miRNAs及其靶基因的表达分析

论文摘要

温度是植物生长的必要条件之一,也是植物自然地理分布的主要限制因素。低温会引起植物的寒害。我国和全世界,每年由于寒害造成粮食作物、蔬菜、果树及经济作物的损失是十分巨大的。因此,加强对植物寒害和抗寒性的研究,以及根据作物品种的抗寒能力科学地确定其种植地区和播种期,培育抗寒力强的新品种,已成为农业生产中的重要问题之一。研究表明微小RNA （miRNAs）在植物中响应许多非生物胁迫中扮演着十分重要的角色。虽然许多niRNAs被鉴定可以被冷和低温胁迫所调控,但是miRNAs在植物的低温耐受中功能的相关研究很少。我们使用高山离子芥这种具有强耐冷、抗冻能力的高山冰缘植物作为材料,通过高通量测序预测了高山离子芥中低温胁迫调控的miRNAs,通过基因本体论（GO）比较他们靶基因的特征和表达模式。随后进行实时荧光定量PCR验证,主要结果如下：（1）我们预测共获得了46个新颖的miRNAs,命名分别为cb-m0001、 cb-m0002,以此类推直到cb-m0046,这其中包括10个保守的miRNAs。（2）通过生物信息学分析从高山离子芥中获得了133个保守miRNAs,其中有130个在高山离子芥转录组中具有预测的靶基因,但仅有9个保守的miRNAs中可能被低温所调控,它们分别是miR390、miR164、miR164a、miR168、 miR161、miR158、miR169a、miR159和miR169。（3）对部分保守miRNA进行了qPCR验证分析。结果发现miR390、miR164、 miR164a和miR168被冷胁迫所上调,而miR161、miR158在冷胁迫下表达量也上升,可具有显著差异,冷处理1和生物学重复冷处理2的差异太过显著,不能准确判断其在冷胁迫下的表达量,miR169a和miR159的表达在冷处理和室温对照下几乎没有差异,而miR169的表达在冷胁迫下低于室温对照。（4）对其miRNA164a的靶基因CB7248进行克隆,测序结果显示,扩增产物长度分别为400bp和3000bp且没有碱基突变。将测序结果与GenBank上登陆的基因进行DNAMAN序列比较分析,结果显示同源性可达100%。（5）CB7248的拟南芥同源基因在抗病应答过程中表现出重要的作用,并与植物的耐冷性具有一定的关系。因此,本论文使用拟南芥同源基因的突变体进行了研究。结果表明,用PstDC3000菌液浸染拟南芥cb3、cb6、cb9,对照为野生型col,结果显示,菌液浸染后的cb3、cb6、cb9植株在冷处理24h后其耐冷性显著高于野生型拟南芥。本论文对高山冰缘植物高山离子芥中的miRNAs进行高通量测序,并进行保守miRNAs和靶基因的分析,验证了冷胁迫所调控的miRNA在高山离子芥中的表达情况,为研究植物低温耐受机理提供了大量的基因序列和功能信息,为进一步研究高山离子芥耐寒抗冻机理提供了丰富的资源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 引言
• 1.1 植物冷胁迫
• 1.1.1 植物的冷驯化及其影响因素
• 1.1.2 植物响应低温胁迫的生理生化和分子生物学机制
• 1.2 MIRNA（MICRORNA）微小RNA
• 1.2.1 miRNA的特点
• 1.2.2 miRNA的生物合成
• 1.2.3 植物miRNA的作用方式
• 1.2.4 植物中miRNA的生物学功能
• 1.2.5 miRNA的预测及验证方法
• 1.2.6 植物逆境胁迫响应的miRNA
• 1.2.7 miRNA与植物抗病性
• 1.3 高山离子芥在植物耐寒、抗冻机理研究中的意义
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 第二部分 实验材料与方法
• 2.1 冷胁迫调控的MIRNA的高通量测序
• 2.1.1 实验材料及处理
• 2.1.2 高山离子芥总RNA提取
• 2.1.3 深度测序
• 2.1.4 小RNAs的处理和miRNA鉴定/预测
• 2.1.5 sRNAs和靶基因的表达分析
• 2.1.6 功能基因的基因本体论（GO）特征
• 2.2 实时定量PCR验证MIRNA的表达的实验材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 引物序列
• 2.2.3 高山离子芥总RNA的提取（方法同前）
• 2.2.4 DNaseI（RNase free）处理总RNA
• 2.2.5 反转录为cDNA
• 2.2.6 实时定量PCR（qPCR）内参基因的筛选
• 2.2.7 实时定量PCR（qPCR）分析
• 2.3 高山离子芥基因的克隆
• 2.3.1 实验材料及处理
• 2.3.2 总RNA的提取（同前）
• 2.3.3 反转录获得cDNA
• 2.3.4 CB7248长片段的获得
• 2.3.5 高山离子芥CB7248短片段的获得
• 2.4 DC3000菌液浸染实验方法
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.2 实验方法
• 2.5 高山离子芥耐冷生理学研究
• 2.5.1 实验材料及处理
• 2.5.2 电导率的测定
• 2.5.3 相对细胞活力的测定
• 第三部分 实验结果
• 3.1 低温胁迫调控的MIRNAs和它的靶基因发现和表达分析
• 3.1.1 mRNA转录组测序数据
• 3.1.2 miRNAs测序
• 3.1.3 在高山离子芥中鉴别出冷胁迫调控的保守miRNAs
• 3.1.4 高山离子芥中冷胁迫调节miRNAs（CSR miRNAs）的预测
• 3.1.5 高山离子芥中保守的miRNAs和CSRmiRNA预测的目标功能基因的GO分析
• 3.2 MIRNA的实时定量QPCR表达分析
• 3.2.1 miRNA实时定量qPCR内参基因的筛选
• 3.2.2 miRNA实时定量qPCR表达分析
• 3.3 CB7248基因的克隆
• 3.4 DC3000菌液浸染拟南芥
• 3.5 高山离子芥生理学研究
• 第四部分 讨论
• 4.1 深度测序结果、基因表达分析
• 4.2 MIRNA的实时荧光定量PCR表达分析
• 4.3 高山离子芥耐冷、抗冻的生理学研究
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 在学期间的研究成果
• 致谢