黄瓜花叶病毒基因组表达与寄主microRNA的相关性研究

论文摘要

近年来,病毒的发生日益猖獗,其对社会和人类造成的危害也不断加重,在突发性流行的病毒中,大部分都是（+）RNA病毒。人们对该类病毒已有一定的认识,它们具有简单的分子组成和结构,基因组RNA具有mRNA的功能,直接指导蛋白质的合成。然而,由于目前该类病毒的复制和致病机理还不清楚,使得我们对在面临病毒爆发时常常十分被动,对病害进行控制和治疗时也往往束手无策。其中,缺少高效、可靠、灵敏的实验手段对病毒基因表达的时序变化规律进行全程监控,是制约我们深入认识该类病毒的瓶颈之一。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）是目前世界上发生最普遍和危害最严重的植物病毒,也是在中国研究最多的植物病毒之一。作为典型的多分体（+）RNA病毒,其具有三条基因组RNA（RNA1、RNA2、RNA3）和两条亚基因组（RNA4、RNA4A）。在寄主体内,负责CMV复制、移动、包装、致病性等的5种必需蛋白的含量,分别由单独由一条基因组/亚基因组的表达量决定。因此,对不同感染时期、不同致病条件下、不同寄主组织中病毒各基因组的表达量变化进行监测,探索寄主症状的发生与病毒各基因组的消长关系,将为我们认识CMV的复制和致病机理,研究环境、寄主和病毒三者之间的关系,寻找应对该类病毒的控制和治疗方法开创新天地。microRNAs（miRNAs）是一类广泛存在于真核生物中、长度21-24nt的单链小RNA分子。近年来,越来越多的研究表明,miRNAs在植物基因表达调控、病毒-寄主的互作过程中起非常重要的作用。然而,由于其分子小,并且某些miRNAs只在特定细胞、特定内外因素诱导下瞬时表达,还有些miRNAs的表达量很低,传统的核酸分析方法很难做到高灵敏度和高特异性,迫切需要高灵敏度、高特异性和高通量的定性/定量检测方法,帮助我们进一步深入研究miRNAs的分子和细胞调控功能。随着科学技术的不断发展,新兴的实验方法和手段为上述问题的解决开辟了新途径。荧光定量PCR和基因芯片是近年来发展起来的新技术,基于其在基因定量和定性分析方面高通量、高效率的特点,它们在分子生物学上的应用日益广泛,在基因表达、核酸定量分析等方面的重要作用日益显现。本论文就荧光定量PCR和基因芯片技术在黄瓜植物病毒基因组RNAs的时序表达和寄主miRNAs对病毒侵染的响应研究方面,进行了以下工作:1.在国际上首次建立了对多分体（+）RNA病毒的各基因组进行绝对/相对定量分析的实验体系。首次利用SYBR Green I荧光定量RT-PCR,确定了CMV病毒粒子中RNA1、RNA2、RNA3和RNA4的绝对拷贝数分别为（4.47±0.5）×107、（4.87±0.33）×107、（5.57±0.25）×107、（1.60±0.09）×108和（4.20±0.11）x108 copies/μl,对应其比例为RNA 1:2:3:4=1.00:1.17（±0.11）:3.58（±0.20）:5.81（±0.31）。并利用Northem杂交和Lab-on-a-Chip对该实验结果进行了验证。与常规的RNA定量分析体系相比较,荧光定量RT-PCR具有较高的灵敏度和准确性。此外,以18S rRNA为内参照,建立了对寄主组织中CMV各基因组/亚基因组表达量的时序变化进行相对定量分析的实验体系,分析了致弱/非致弱卫星RNA对辅助病毒各基因组表达量的影响。初步探讨了寄主症状的改变与CMV各基因组以及卫星RNA表达量变化之间的关系。2.优化了荧光定量RT-PCR实验数据处理过程。目前,荧光定量PCR技术所面临的最突出问题是实验数据庞大、分析困难,另外定量结果存在误差、不够准确,主要原因是数据处理方法导致的。针对这些问题,我们拓展了前人的研究,将CF值（calibration factor,荧光信号与DNA分子之间的相关系数）的计算引入最新发展起来的几种实验数据处理方法中,用F0（第0个循环的荧光值）代替Ct值,对5种CMV病毒粒子中各个基因组RNA用不同方法分别进行绝对定量分析。其中LinReg PCR（线性回归PCR）方法以操作简单、计算方便、定量结果准确显示出更好的优越性。在此基础上,我们提出了应用该方法对不同基因的含量进行绝对/相对定量分析的简便计算公式,使得基因间的相对量比较更加简捷方便。3.设计合成了植物miRNAs检测和表达分析芯片,补充了数据库中番茄miRNAs及其靶标mRNAs的序列信息,并分析了不同病毒侵染对寄主番茄miRNAs表达的影响。利用植物miRNAs的保守性,根据数据库中已有物种的UniquemiRNA的序列信息,设计合成了植物miRNAs检测和表达分析芯片。应用该芯片,在健康、感病的番茄叶组织中共检测到25个家族的105条Unique miRNA的杂交信号。与Mock比较,病毒侵染后,共引起番茄89条miRNA发生了差异性表达,并且不同病毒对番茄miRNAs表达图谱的影响各异,暗示他们通过不同的方式干扰miRNAs的表达。据我们所知,这是目前番茄miRNA对病毒侵染响应的最广泛的一次分析,将为病毒致病机理、病毒与寄主互作的研究提供了新的分子信息和理论依据。4.首次建立了植物miRNAs茎环结构荧光定量RT-PCR定量分析体系。根据芯片杂交结果,筛选出了与病毒侵染密切相关的植物miRNAs。然后利用3′-RACE的方法,克隆出部分miRNAs的靶标mRNAs序列。最后,借鉴并拓展人类及动物组织中miRNAs的研究,针对miRNAs长度小的特点,设计了茎环结构的反转录引物（stem-loop RT primer）。并以染料代替探针,首次利用荧光定量RT-PCR,特异性的检测了病毒侵染对番茄叶组织中7条miRNA及其5条靶标mRNA表达量的影响。研究结果证实在病毒一寄主的互作过程中,病毒利用miRNA途径实现对寄主基因表达的调控,并导致相应症状的产生。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄瓜花叶病毒
• 1.1.1 黄瓜花叶病毒生物学特点
• 1.1.2 黄瓜花叶病毒基因组结构
• 1.1.3 黄瓜花叶病毒卫星RNA
• 1.1.4 黄瓜花叶病毒各（亚）基因组的复制、积累与寄主症状产生之间的关系
• 1.1.5 病毒侵染与植物miRNA之间的关系
• 1.2 植物病毒的检测方法
• 1.2.1 生物学检测法
• 1.2.2 血清学检测法
• 1.2.3 电子显微镜检测法
• 1.2.3.1 电镜负染检测法
• 1.2.3.2 电镜超薄切片法
• 1.2.3.3 免疫电镜检测法
• 1.2.4 分子生物学检测方法
• 1.2.4.1 核酸分子杂交技术
• 1.2.4.2 双链RNA电泳技术
• 1.2.4.3 聚合酶链式反应技术
• 1.2.4.4 实时荧光定量PCR技术
• 1.3 荧光定量PCR技术及其在植物病毒研究中的应用
• 1.3.1 荧光定量PCR技术的原理
• 1.3.2 荧光定量PCR技术的种类
• 1.3.2.1 荧光染料法
• 1.3.2.2 荧光探针法
• 1.3.3 实时荧光定量PCR的特点
• 1.3.4 荧光定量PCR在植物病毒研究中的应用
• 1.4 本论文的研究内容与目的
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 预期目标
• 第二章 黄瓜花叶病毒荧光定量PCR实验分析体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 寄主植物
• 2.1.2 病毒
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 引物设计
• 2.1.5 植物总RNA提取
• 2.1.6 标准品的制备
• 2.1.6.1 酶切
• 2.1.6.2 体外转录
• 2.1.6.3 标准品拷贝数计算
• 2.1.7 病毒粒子的制备
• 2.1.8 病毒粒子中CMV基因组RNAs的制备
• 2.1.9 RT-PCR扩增
• 2.1.9.1 反转录（RT）反应:
• 2.1.9.2 普通PCR反应:
• 2.1.9.3 荧光定量PCR:
• 2.1.10 Lab-on-a-Chip分析CMV病毒粒子中各基因组的含量
• 2.1.10.1 制胶
• 2.1.10.2 注胶
• 2.1.10.3 加样
• 2.1.11 Northern杂交分析CMV病毒粒子中各基因组的含量
• 2.1.12 数据处理
• 2.1.12.1 荧光定量标准曲线的制作
• 2.1.12.2 荧光定量PCR效率计算
• 2.1.12.3 Northern杂交信号处理
• 2.1.12.4 Lab-on-a-Chip数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 CMV-Fny基因组RNAs的体外转录
• 2.2.2 荧光定量PCR反应条件的优化
• 2.2.3 引物的筛选
• 2.2.4 PCR扩增特异性的验证
• 2.2.5 标准曲线的建立以及定量检测范围的确定
• 2.2.6 荧光定量PCR确定CMV-Fny病毒粒子中各基因组的拷贝数
• 2.2.7 Lab-on-a-Chip确定CMV-Fny病毒粒子中各基因组的拷贝数
• 2.2.8 Norther杂交确定CMV-Fny病毒粒子中各基因组的拷贝数
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 荧光定量PCR分析卫星RNA对黄瓜花叶病毒各基因组时序表达的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毒源和寄主植物
• 3.1.2 酶与试剂
• 3.1.3 植物总RNA提取
• 3.1.4 RT-PCR扩增
• 3.1.5 Northern杂交
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 CMV-Fny各基因的含量在烟草不同叶位上的变化
• 3.2.2 荧光定量PCR分析Sat369对CMV-Fny各基因累积的影响
• 3.2.3 Northern杂交分析Sat369对CMV-Fny各基因累积的的影响
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 荧光定量PCR试验数据的处理
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 寄主植物
• 4.1.2 病毒
• 4.1.3 酶与试剂
• 4.1.4 病毒粒子提取
• 4.1.5 总RNA提取
• 4.1.6 标准品的制备
• 4.1.7 荧光定量PCR
• 4.1.8 实验数据处理
• 4.1.8.1 SCF法处理荧光定量PCR数据
• 4.1.8.2 LinReg程序处理荧光定量PCR数据
• 4.1.8.3 DART程序处理荧光定量PCR数据
• 0值对不同基因的含量进行比较'>4.1.9 利用N₀值对不同基因的含量进行比较
• 4.1.10 Northern杂交
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 标准曲线计算病毒粒子中CMV各基因组的含量
• 4.2.2 SCF法计算病毒粒子中CMV各基因组的含量
• 4.2.3 LinReg PCR和DART程序计算病毒粒子中CMV各基因组的含量
• 4.2.4 Northern杂交分析病毒粒子中CMV各基因组的含量
• 0计算Tl-sat对CMV基因组累积的影响'>4.2.5 利用N₀计算Tl-sat对CMV基因组累积的影响
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 病毒侵染引起番茄MIRNA差异表达的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 寄主植物
• 5.1.2 病毒
• 5.1.3 酶与试剂
• 5.1.4 总RNA提取及小RNA分离
• 5.1.5 芯片设计
• 5.1.6 芯片杂交
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 病毒侵染在番茄上引起的症状
• 5.2.2 植物保守性miRNA在番茄上的检测验证
• 5.2.3 病毒侵染对番茄miRNA表达的影响
• 5.3 小结与讨论
• 5.3.1 植物miRNAs的保守性分析
• 5.3.2 番茄miRNAs的差异表达
• 第六章 荧光定量RT-PCR检测番茄MIRNA对病毒侵染的响应
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 寄主植物
• 6.1.2 病毒
• 6.1.3 酶与试剂
• 6.1.4 总RNA提取
• 6.1.5 扩增部分miRNA的靶基因序列
• 6.1.5.1 mRNA纯化
• 6.1.5.2 合成第一链cDNA
• 6.1.5.3 套式PCR反应
• 6.1.5.4 PCR产物割胶回收、克隆
• 6.1.6 荧光定量PCR引物的设计
• 6.1.7 荧光定量RT-PCR
• 6.1.8 实验数据处理
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 CMV和TAV侵染番茄引起的症状
• 6.2.2 番茄ARF8与AGOl基因的克隆和鉴定
• 6.2.3 stem-loop real-time RT-PCR实验体系的分析验证
• 6.2.4 病毒侵染后番茄7条miRNAs表达量的变化
• 6.2.5 病毒侵染后番茄靶标mRNAs表达量的变化
• 6.3 小结与讨论
• 6.3.1 植物miRNA的荧光定量PCR分析
• 6.3.2 番茄miRNA芯片杂交和荧光定量PCR分析结果比较
• 6.3.3 CMV和TAV侵染引起番茄miRNAs和靶标mRNAs的差异表达
• 总结
• 参考文献
• 附件Ⅰ:重要溶液的配制
• 附件Ⅱ:作者简历