油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及其机制

论文摘要

从江苏省镇江市和扬州市采集病样,分离获得油菜菌核病菌168个菌株。依据32个野生菌株药剂敏感性（EC50）频率分布,菌株对腐霉利的敏感基线测定为0.1981±0.0220μg/mL（EC50）和1.1±0.1595μg/mL（MIC）。以5μg/mL（MIC）检测标准,未发现田间抗腐霉利菌株。通过紫外线和药剂诱导,获得高抗腐霉利突变株（EC50>1000μg/mL）。经转管培养20次后,这些抗药菌株抗性表现稳定。以腐霉利敏感菌株YD11S及其诱变产生的抗性菌株YD11-4R、YD11-7R、YD11AR进行比较研究,发现抗性突变株菌丝生长较慢;对离体和田间植株的致病力较弱。但是,在一定浓度（0.52μg/mL）腐霉利处理后,敏感菌株菌丝扭曲,分支增加且短小,甚至细胞肿胀、破裂,原生质外渗,而抗药菌株菌丝形态则无明显变化。与敏感菌株相比,腐霉利抗性菌株无论在高糖（> 40g/L蔗糖）还是高盐（>5g/L NaCl）培养基上均对高渗透压比较敏感,并且菌丝相对电导率较高。这显示抗腐霉利菌株细胞膜透性增大,胞内电解质渗出较多。试验还发现,在含药培养液中,腐霉利敏感菌株菌丝内甘油大量合成和积累,增加462.45%,而抗性菌株菌丝内甘油含量仅稍有增加或有所下降。这表明抗腐霉利菌株对外界渗透压的调节能力要低于敏感菌株。根据已报道AaHK1序列设计特异引物,经PCR扩增和测序,获得腐霉利敏感菌株YD11S和抗性菌株YD11-4R、YD11-7R、YD11AR组氨酸激酶基因保守区域序列1605 bp。与AaHK1相比,敏感菌株组氨酸激酶基因保守区域第449位碱基不同,但编码的氨基酸相同。另外,抗感腐霉利菌株的组氨酸激酶基因保守区域序列有3处（第45、81、625位）碱基差异,但编码的氨基酸一致。由此可见,我国油菜菌核病菌二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性与组氨酸激酶基因保守区域碱基突变无关,是否因组氨酸激酶基因其它序列突变或其他原因还需进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 油菜菌核病及其药剂防治
• 1.1.1 病害循环与危害
• 1.1.2 病害药剂防治
• 1.2 病菌对苯并咪唑类药剂的抗性及其机制
• 1.2.1 病菌抗药性
• 1.2.2 病菌抗药性机制
• 1.3 病菌对二甲酰亚胺类药剂的抗性及其机制
• 1.3.1 药剂杀菌机理
• 1.3.2 病菌抗药性
• 1.3.3 抗药菌株的特性
• 1.3.4 病菌抗药的分子机制
• 1.4 本论文研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 病样采集与菌株分离
• 2.2 供试药剂及主要仪器
• 2.2.1 供试药剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 药剂毒力测定方法
• 2.3.1 含药培养基制备
• 2.3.2 药剂毒力测定
• 2.4 病菌对腐霉利敏感基线的确定与抗性划分
• 2.5 抗腐霉利菌株的诱变方法
• 2.5.1 紫外线诱变
• 2.5.2 药剂诱变
• 2.6 抗腐霉利菌株抗性稳定性的测定
• 2.7 腐霉利对抗感菌株菌丝形态影响的观察
• 2.8 抗感腐霉利菌株生物学特性的比较研究
• 2.8.1 菌丝生长测定
• 2.8.2 菌核生成量测定
• 2.8.3 致病力测定
• 2.9 抗感腐霉利菌株生理生化特性的比较研究
• 2.9.1 菌丝渗透压敏感性测定
• 2.9.2 菌丝相对电导率测定
• 2.9.3 菌丝甘油含量测定
• 2.10 病菌对腐霉利抗性的分子机制研究
• 2.10.1 病菌基因组DNA 提取方法
• 2.10.2 组氨酸激酶基因保守区域PCR 扩增及其产物回收
• 2.10.3 组氨酸激酶基因保守区域碱基序列测定与分析
• 3 结果和分析
• 3.1 油菜菌核病菌对腐霉利的敏感基线与抗性
• 3.1.1 腐霉利敏感基线的确定
• 3.1.2 野生抗药性菌株的检测
• 3.2 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的诱变与抗性
• 3.2.1 抗腐霉利菌株的诱变
• 3.2.2 抗性突变体的抗药性水平
• 3.2.3 抗药突变株的抗性稳定性
• 3.3 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株对其他药剂的抗性
• 3.4 腐霉利对油菜菌核病菌菌丝形态的影响
• 3.5 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生物学特性
• 3.5.1 菌丝生长
• 3.5.2 菌核生成
• 3.5.3 致病力
• 3.6 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性
• 3.6.1 菌丝渗透压敏感性
• 3.6.2 菌丝相对电导率
• 3.6.3 菌丝甘油含量
• 3.7 油菜菌核病菌抗腐霉利的分子机制
• 3.7.1 病菌基因组 DNA 的提取
• 3.7.2 病菌组氨酸激酶基因保守区域PCR 扩增与检测
• 3.7.3 病菌组氨酸激酶基因保守区域序列测定与分析
• 4 讨论
• 4.1 油菜菌核病菌对二甲酰亚胺类药剂的抗性
• 4.2 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的形态与生物学特性
• 4.3 油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性
• 4.4 油菜菌核病菌抗二甲酰亚胺类药剂的分子机制
• 参考文献
• 附录
• 致谢