论文摘要
甘蓝型油菜细胞核雄性不育因其具有不育性彻底,不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险,在杂种优势利用中具有广阔的应用前景,但关于雄性不育的机理研究却相对滞后。雄性不育即不能形成结构和功能正常的花粉,雄蕊的发生是一个非常复杂的过程,包括雄蕊原基形成,孢原细胞出现和分化,孢子体组织各层的形成、分化及凋亡,孢子体细胞的形成和成熟等一系列过程,这个过程受很多花药特异基因调控。目前已在拟南芥、水稻、番茄、烟草等植物中筛选到大量花药特异表达的基因,这些基因发生突变均会引起花药发育异常,导致雄性不育,模式植物不育机理研究给甘蓝型油菜细胞核雄性不育机理的研究提供了基础。BnATA20是从甘蓝型油菜显性核不育材料Rs1046可育和不育的花药构建的差减文库中筛选到差异表达的基因,为了探究其具体功能和败育机制,从以下四个方面展开工作：1.农杆菌介导甘蓝型油菜遗传转化体系进行改善,主要侧重于激素配比,选择最佳激素配比,提高转化效率。2.通过农杆菌介导的遗传转化方法,将BnATA20反义抑制载体导入受体材料甘蓝型油菜华双5号中,观察基因缺失突变体是否败育及败育性状是否稳定遗传。3.通过制作基因缺失突变体花药发育过程的石蜡切片以及扫描电镜、透射电镜等亚细胞观察,了解花药败育特征,探究花药败育机制,验证BnATA20基因主要功能。4.通过RT-PCR及real time PCR等技术确定BnATA20基因在花药中的表达情况,以及育性相关基因在BnATA20突变体中表达情况,确定BnATA20表达特性。主要结论如下：1.在农杆菌介导甘蓝型油菜遗传转化过程中,BAP/Zeatin组合高效诱导愈伤形成和芽分化,以BAP4mg/L和Zeatin 2 mg/L组合诱导愈伤及BAP3mg/L和Zeatin 2mg/L组合诱导出芽具有最佳效果。2.利用农杆菌介导方法获得BnATA20反义抑制植株63株,11株为PCR阳性,其中3株雄蕊瘦小干瘪,雄蕊花丝较短,为雄性不育植株,雌蕊发育正常。3个不育株系与野生型杂交后代都表现为雄性不育,不育性状稳定遗传。3.bnata20突变体花药发育过程的石蜡切片、扫描电镜和透射电镜观察显示,绒毡层细胞在四分体末期开始异常,胞质变稀松,细胞轮廓模糊,细胞之间没有可辨识间隙,并成团向药室入侵；小孢子受挤压,解体凋亡,花药败育。BnATA20基因在单核小孢子至单核花粉粒时期的绒毡层细胞中特异表达,控制绒毡层细胞的形成和早期功能。基因表达分析显示BnATA20调控MS1、NEF、BnA9、BnA6的表达。