论文摘要
纳米技术在药物载体领域的运用催生了一大批纳米药物载体。由于纳米粒子具有的独特性质,纳米药物载体表现出许多优异的性能和全新的功能。现在,已经有多种纳米药物载体参与疫苗的设计与制备并取得良好效果。纳米疫苗起效的首要因素是抗原提呈细胞（APC）对纳米药物的摄取和递呈。虽然纳米疫苗的有效成分为抗原蛋白、多肽或编码抗原的基因,但纳米药物载体本身亦被APC摄取,此过程中可能会对APC的活性与功能产生一定影响。纳米乳剂与纳米脂质体作为纳米药物载体都有着广泛的应用前景,我实验室已在前期研究中制备了纳米乳剂及纳米脂质体包裹肿瘤特异性抗原的肿瘤纳米疫苗,并在动物实验中取得了良好的效果。但在进一步的研究中,我们发现纳米乳剂在动物体内可能有一定毒性,当达到一定用药量后与对照组相比,乳剂组的小鼠死亡率明显增高。DC作为抗原递呈能力最强、唯一可诱导静止T细胞活化的APC越来越受到人们重视。以DC为靶向的纳米疫苗药物载体已成为纳米医药领域研究的新方向,特别是在肿瘤免疫中,利用纳米药物载体将肿瘤特异性抗原靶向输送给DC,通过DC的加工将抗原肽递呈到表面MHC-Ⅰ类分子上,激活下游的CD8+T细胞,产生针对肿瘤特异性抗原的CTL克隆,最终发挥杀伤肿瘤细胞的作用。目前还没有文献报道纳米药物载体对人DC的毒性作用和活性影响。本研究首先建立了人外周血单个核细胞（PBMC）来源DC和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员人外周血干细胞（PBSC）来源DC的培养方法。在此基础上,以形态学为主要研究手段,研究了纳米乳剂及纳米脂质体在体外对人PBMC来源树突状细胞的影响。本研究主要内容有:1.人PBMC及PBSC来源树突状细胞的培养目的:改进人PBMC分离培养树突状细胞的方法,以获得数量与纯度更高的树突状细胞。建立经G-CSF动员PBSC来源DC的培养方法。方法:利用连续贴壁法分离获得人外周血来源CD14+前体细胞,经粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导产生成熟DC。骨髓移植健康供者在G-CSF动员4d后,Cobe SpectraTM血细胞分离机分离获得PBSC,以其为前体细胞诱导培养产生DC。流式细胞仪（FCM）检测两种来源DC表面标志物表达水平,透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察PBMC来源DC的形态和超微结构。结果:连续贴壁法体外分离培养人PBMC来源DC,所获得DC数量和纯度均高于以往一次贴壁分离培养的DC。在GM-CSF、IL-4以及TNF-α的联合诱导培养7d后,DC高表达CD1a（44.16%）、CD40（75.04%）、HLA-DR（95.98%）、CD83（57.25）、CD86（73.20%）。SEM观察到DC典型形态:细胞直径多在10μm以上,表面微绒毛丰富,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起。TEM观察可见:DC胞浆内溶酶体丰富,Golgi复合体发达,还可见到粗面内质网（RER）及其周围分布的丰富的线粒体（Mit）。细胞核不规则,常偏于一侧。培养第15dDC还观察到明显的凋亡与吞噬现象。经G-CSF动员PBSC诱导培养所获得DC的数量更多,5ml富集PBSC的分离液可培养超过107个DC,PBSC来源DC诱导培养所需时间较PBMC来源DC长2-3d,培养过程中消耗更多细胞因子,所获得DC高表达CD1a（48.73%）、CD40（85.04%）、HLA-DR（91.12 %）、CD83（55.11%）和CD86（80.10%）,其表型与形态与PBMC来源DC无明显差异。结论:在传统方法的基础上,建立了连续贴壁法分离培养PBMC来源的DC。与传统方法相比,改进后的方法可分离培养数量较大、纯度较高的人PBMC来源DC。同时建立了G-CSF动员及细胞分离机分离PBSC诱导培养产生DC的方法,此方法虽然培养周期较长且费用高,但获得DC数量非常多,血液其他成分浪费少,应用前景广阔。2.纳米乳剂/纳米脂质体对DC的影响目的:了解纳米乳剂/纳米脂质体对人DC的影响。方法:人PBMC来源DC培养5d后,将不成熟DC分别负载不同浓度纳米乳剂/纳米脂质体,孵育48h,光镜观察DC形态变化,FCM检测DC表面分子表达,TEM观察DC摄取纳米药物载体后形态与亚细胞结构的变化。MTT检测负载纳米微粒的DC对自体T淋巴细胞的促增殖能力。结果:①纳米乳剂组:在1×105 /1ml DC中加入100μl纳米乳剂后,光镜观察发现DC发生严重水肿,最终崩解坏死。在1×105 /ml DC中加入纳米乳剂20-50μl,光镜下观察DC肿胀,TEM显示大部分DC发生细胞水肿,胞内各种细胞器均发生扩张,胞核变大,水肿细胞内有脂滴样物质,部分细胞胞膜断裂甚至坏死崩解。在1×105 /ml DC中加入10μl乳剂,光镜下细胞形态未发生明显变化,TEM仅见细胞摄取纳米乳剂后形成的吞噬溶酶体。FCM检测显示负载10μl纳米乳剂后,DC表面CD83表达量上调。MTT结果显示,当纳米乳剂剂量达到20μl后,DC促进T细胞增殖的能力明显下降。②纳米脂质体组:在1×105 /ml DC中加入50或100μl的纳米脂质体后,光镜观察细胞形态变圆,表面树枝样突起减少,TEM显示DC内有大量脂质沉积,部分细胞内有胆固醇结晶,但未见细胞发生坏死或凋亡。FCM检测显示:DC表面分子CD83表达量未见变化,其促进T细胞增殖的能力也无明显变化。结论:适宜剂量的纳米乳剂可作为一种药物载体被DC细胞有效吞噬摄取,并作为一种外来抗原促进DC的成熟分化。但当1×105 /ml DC中加入的乳剂剂量超过20μl时,DC出现水样变性甚至坏死,毒性明显。DC对纳米脂质体的相容性明显强于纳米乳剂,在剂量达到100μl后DC仍具有良好的形态与活性。本研究在体外条件下模拟和评价了纳米脂质体对抗原加工、处理和递呈具有关键作用的DC的毒性和活性的影响,结果以纳米脂质体作为抗原载体对DC是无毒性的,活性亦无影响,此为纳米脂质体肿瘤疫苗的研发提供了重要的实验基依据。