玉米温敏自交不亲和系HE97花丝与花粉的差异蛋白组分析

论文摘要

自交不亲和性在研究细胞信号传导和杂种优势利用中有重要意义,是植物分子生物学和遗传育种的一个热点领域,目前这一现象的分子机制知之甚少,研究主要集中在自交不亲和基因的精细定位和图位克隆方面。HE97是一种玉米温敏自交不亲和材料,它在不同温度生态条件下存在亲和性的转换。前期研究证明HE97亲和性转换的敏感时期是雄穗小花分化期（雌穗生长锥伸长期）,主要受日最低温度的影响,其亲和性转换的温度区间为20-24℃。当最低温度低于20℃时表现不亲和,最高温度高于24℃时表现亲和。本研究在前期研究的基础上,于2008年4月19日至2008年6月10日,在河南农业大学科教园区对HE97进行分期播种,每期材料雄穗散粉和雌穗花丝抽出3-4厘米后取样自交,选择亲和与不亲和的两期材料分别提取花粉和花粉总蛋白,利用蛋白质双向电泳和质谱技术分析鉴定亲和性转换前后花丝与花粉差异表达蛋白质。本研究的主要结果如下:1.不同播种期内HE97的雄穗均能正常散粉,雌穗均能正常吐丝,但不同时期HE97自交果穗的结实性却存在显著的差异。该结果与前人观察结果一致。2.以花丝为材料,比较了三种不同蛋白质提取方法三氯乙酸/丙酮法、酚提取法和改良的酚提取法对双向电泳结果的影响,并在蛋白质上样量、等电聚焦条件及SDS-PAGE凝胶浓度等方面进行了探索与优化。结果表明,与酚提取法及改良的酚提取法相比,采用三氯乙酸/丙酮提取法提取蛋白质操作简便,所得的双向电泳图谱蛋白质点数较多,图谱背景也比较清晰。3.利用蛋白质双向电泳技术对玉米温敏自交不亲和系HE97花丝与花粉不同亲和条件下进行了蛋白图谱分析。结果表明,大部分蛋白质集中分布在pH 4～7区域内,花粉中发现有340个蛋白质点,花丝中670个蛋白质点。有9个蛋白质点在不同亲和阶段表现差异,其中P2蛋白点是仅在不亲和花粉中表达,P1蛋白质点在不亲和花粉中下调表达;S1、S2、S7蛋白点仅在不亲和花丝中表达,S4、S5蛋白点仅在亲和花丝中表达,S6蛋白点在不亲和花丝中上调表达,S3蛋白点在亲和花丝中上调表达。4.利用二级质谱（LC/ESI-MS/MS ）和蛋白数据库分析鉴定差异蛋白,对9个差异表达蛋白点进行鉴定,共得到7个不同的蛋白序列,其中2个与信号传导有关。5.克隆了P1和S7两个自交不亲和相关基因,其中候选基因P1与自交不亲和植物麝香百合名为LlANK的全长cDNA序列相似性很高,LlANK的短暂沉默或过度表达与花粉萌发或花粉管生长密切相关;基因S7推测的蛋白在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物自交不亲和性及其类型
• 1.2 孢子体自交不亲和研究进展
• 1.2.1 孢子体自交不亲和表现
• 1.2.2 孢子体自交不亲和发生机制
• 1.3 配子体自交不亲和研究进展
• 1.3.1 以S-RNase 为基础的SI 信号转导途径
• 1.3.1.1 SI 信号分子—S-RNase
• 1.3.1.2 信号分子的接受体——花粉S 蛋白
• 1.3.1.3 以S-RNase 为基础的细胞信号转导途径
• 1.3.2 罂粟科SI 信号转导的研究进展
• 1.4 禾本科自交不亲和性机理
• 1.5 蛋白质组学的研究进展
• 1.5.1 蛋白质组学分析技术
• 1.5.1.1 双向电泳
• 1.5.1.2 图像分析
• 1.5.2 蛋白质组学在植物研究中的应用
• 1.5.2.1 逆境胁迫下植物蛋白质组学研究
• 1.5.2.2 突变体的蛋白质组学研究
• 1.5.2.3 植物亚细胞蛋白质组学
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 试剂
• 3.3 仪器
• 3.4 蛋白质组分析方法
• 3.4.1 试验材料的种植、取样与鉴定
• 3.4.2 蛋白质的提取
• 3.4.2.1 三氯乙酸/丙酮法（TCA/acetone extraction）
• 3.4.2.2 酚提取法（phenol extraction）
• 3.4.2.3 改良的酚提取法
• 3.4.3 蛋白质的溶解
• 3.4.4 蛋白质样品浓度测定
• 3.4.5 第一向等电聚焦电泳条件的优化
• 3.4.6 第二向SDS-PAGE 电泳
• 3.4.7 凝胶染色
• 3.4.8 凝胶图像分析、蛋白质点的胶内酶解和串联质谱分析
• 3.5 分子生物学类实验方法
• 3.5.1 基因组DNA 的提取
• 3.5.2 P1 和S7 基因DNA 序列的克隆
• 3.5.2.1 引物
• 3.5.2.2 反应体系
• 3.5.2.3 扩增产物的电泳纯化
• 3.5.2.4 DNA 片段的克隆
• 3.5.2.5 PCR 检测阳性克隆
• 3.5.2.6 PCR 产物的测序
• 3.5.3 拟南芥转基因功能验证
• 3.5.3.1 植物材料与种植方法
• 3.5.3.2 引物设计
• 3.5.3.3 基因序列的扩增
• 3.5.3.4 表达载体构建
• 3.5.3.5 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.5.3.6 PCR 验证及菌种保存
• 3.5.3.7 拟南芥转化
• 3.5.3.8 转基因拟南芥的筛选鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 自交不亲和与亲和阶段的田间表现
• 4.2 三种方法提取的蛋白质样品双向电泳效果比较
• 4.3 不同聚焦时间对双向电泳图谱的影响
• 4.4 不同丙烯酰胺浓度对蛋白质分辨率的影响
• 4.5 不同上样量对蛋白质分辨率的影响
• 4.6 蛋白质表达分析
• 4.7 差异蛋白点的质谱鉴定
• 4.8 p1 及s7 基因DNA 序列的克隆
• 4.9 拟南芥转基因功能验证试验
• 4.9.1 植物表达载体PBI-P1 及PBI-S7 的构建
• 4.9.2 重组质粒PBI- P1 及PBI-S7 转化农杆菌
• 4.9.3 转基因拟南芥的筛选
• 5 讨论
• 5.1 如何获得高重现性的双向电泳图谱
• 5.2 差异蛋白质的功能
• 5.3 关于自交不亲和相关基因P1 及S7
• 5.4 进一步的研究设想
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• Abstract