论文摘要
阿维菌素（avermectins）是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）发酵产生的是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,在医药、农业和畜牧业生产中有良好的应用,并且具有广阔的市场前景。本文对工业生产阿维菌素的阿维链霉菌菌株进行了基因工程改造研究。orfX,aveR,afsR,afsQ1Q2是链霉菌中发现的四个正调控基因。本试验将上述4个正调控基因通过接合转移法导入到阿维菌素工业生产菌株Z1中,检测其对阿维菌素产生的影响。试验结果表明orfX基因有明显促进作用,阿维菌素产量提高了约30%;aveR基因作用不十分明显;afsR和afsQ1Q2基因使产素水平明显降低。本试验进行了工业阿维链霉菌原生质体制备研究。试验结果显示阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为:250ml三角瓶装有35ml含0.5%甘氨酸的YEME培养基,孢子悬液接种,28℃,200r/min培养40h;3000r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/ml的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50min完成原生质体制备。50%PEG1000做促融剂,原生质体融合率最高。利用OLM菌株（AprR）和Z1菌株（SpcR）进行连续融合发现,经过连续5轮融合,融合效率可达41.6%,并达到稳定。以四株不同产量和来源的阿维链霉菌作为出发菌株,通过过五轮基因组重排处理,比较发现,随着基因组重排的深入,重组群体中高效价菌株的比率例在逐步提高。五轮基因组重排后得到了2株高产菌株,菌株F5-64和F5-170,其效价分别达到3322 ug/mL和3328 ug/mL。
论文目录
摘要Abstract1 前言1.1 阿维链霉菌简介1.2 阿维菌素的生物合成1.2.1 同位素标记前体的掺入1.2.2 阿维菌素聚酮体的生物合成1.2.3 起始糖苷配基的修饰1.2.4 齐墩果糖的生物合成和连接1.3 阿维菌素的衍生物1.3.1 依维菌素1.3.2 多拉菌素1.3.3 埃玛菌素和埃伯利诺菌素1.3.4 塞拉菌素1.3.5 米尔贝霉素和尼玛霉素1.4 阿维菌素代谢调控的研究1.4.1 途径特异性调控1.4.2 多效调控1.4.3 全局调控1.5 菌种选育策略1.5.1 诱变育种1.5.2 基因重排育种1.5.3 基因组重排技术1.6 本课题研究的立题依据,目的和意义2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株2.1.2 试验仪器与试剂2.1.2.1 主要药品和试剂2.1.2.2 主要试验设备2.1.2.3 培养基和缓冲液配方2.2 试验方法2.2.1 链霉菌培养及菌种保藏2.2.2 大肠杆菌质粒的DNA小量提取2.2.3 大肠杆菌和链霉菌质粒DNA的少量快速提取及检测2+法感受态细胞的制备与转化'>2.2.4 E.coli的Ca2+法感受态细胞的制备与转化2.2.5 质粒从大肠杆菌向链霉菌的两亲本接合转移2.3 原生质体制备,再生与融合2.3.1 原生质体制备2.3.2 原生质体的再生2.3.3 原生质体的计数方法2.3.4 原生质体再生率的计算2.3.5 原生质体融合与再生2.3.6 原生质体融合率的计算2.4 紫外诱变时间的确定3 结果与分析3.1 正调控基因对阿维菌素工业生产菌株的产量的影响3.1.1 正调控基因通过结合转移法导入阿维链霉菌3.1.2 导入正调控基因的阿维链霉菌发酵试验3.1.3 导入26号正调控基因的阿维链霉菌菌株的单孢分离3.1.4 选育高产菌株的稳定性3.1.5 小结3.2 基因重排法选育结果3.2.1 原生质体制备的影响因素3.2.1.1 菌丝培养时间对原生质体形成的影响3.2.1.2 甘氨酸对原生质体形成的影响3.2.1.3 溶菌酶浓度对原生质体形成的影响3.2.1.4 酶解温度对原生质体形成的影响3.2.1.5 酶解时间对原生质体形成的影响3.2.1.6 PEG相对分子量对融合率的影响3.2.1.7 PEG1000浓度对融合率的影响3.2.1.8 小结3.3 基因组重排方法3.3.1 融合效率的测定3.3.2 Z1与OLM两菌株连续五轮融合3.3.3 四菌株基因组重排3.3.4 连续五轮基因组重排试验数据分析3.3.5 诱变处理方法3.3.5.1 紫外诱变处理3.3.5.2 第三轮和第四轮融合试验数据分析3.3.5.3 重排高产菌株的稳定性3.4 小结3.4.1 运用基因组重排技术筛选高产菌株3.4.1.1 连续原生质体融合3.4.1.2 基因组重排选育高产菌株4 讨论5 参考文献6 致谢
相关论文文献
标签：阿维链霉菌论文; 阿维菌素论文; 调控基因论文; 基因组重排技术论文;
