蛋白质泛素化的生物信息学分析

论文摘要

蛋白质翻译后修饰对蛋白质的成熟,结构和功能的多样性起着重要的作用。然而由于蛋白质翻译后修饰的多样性、普遍性、动态性,传统的实验方法严重制约了研究进展。现在,在实验研究基础上,基于不同算法开发了多种计算工具,用来预测蛋白质共价修饰的位点,大大加快了研究的进展。泛素化作为一种十分重要的翻译后修饰,在细胞内发挥着重要的作用。β-TrCP（beta-transducin repeat-containing protein）是众多E3连接酶中的一种,通过识别某些特定的底物引导其泛素化,从而参与生命活动中各项重要过程。在本研究中,我们开发了针对β-TrCP结合位点预测的GPS-BeTrIP 1.0。另外,我们从GPS-BeTrIP 1.0预测的结果中挑选Ankra2、Nudc和Trf1作为实验验证的对象。体外的生化试验有力地证明了Ankra2、Nudc和β-TrCP存在相互作用。并且Ankra2上的S280、S284对促进其降解起重要作用。近来研究表明,在原核生物中,原核类泛素蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein, PUP）被发现起到类似于真核生物中的泛素的作用。Pupylation是PUP通过一系列生化反应连接到底物上的过程。我们开发了预测pupylation位点的计算工具GPS-PUP 1.0。我们收集了238个不知道确切位点的底物,并以此检测GPS-PUP 1.0性能。我们成功预测出了85%底物蛋白质,而且每个底物蛋白质上至少有一个潜在位点。不仅如此我们还系统的对潜在的pupylation底物做了更深一步的GO（Gene Ontology）注释。分析发现pupylation的底物十分广泛,参与调节各种生物学过程,如压力应答和新陈代谢等。综上所述,我们对以上两种翻译后修饰所做的系统性分析为实验学家提供了非常可靠的数据资源。我们有理由相信将我们的工作与实验验证有机的结合将会大大推动这两种翻译后修饰的研究。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第1章 绪论
• 1.1 蛋白质翻译后修饰
• 1.2 蛋白质泛素化
• 1.3 β-TrCP
• 1.4 原核生物的类泛素化
• 第2章 β-TrCP 介导泛素化的生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 数据收集和整理
• 2.2.2 GPS 2.2 算法
• 2.2.3 性能评估
• 2.2.4 实验材料
• 2.2.4.1 本论文中所用载体及其来源
• 2.2.4.2 本论文中所用质粒
• 2.2.4.3 本论文中所用细胞株及其来源
• 2.2.4.4 本论文中所用抗体及其来源
• 2.2.4.5 本论文中所用试剂及其来源
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.5.1 PCR 反应
• 2.2.5.2 琼脂糖电泳及DNA 片段的回收
• 2.2.5.3 酶切反应
• 2.2.5.4 连接反应
• 2.2.5.5 制备E.coli 感受态细胞
• 2.2.5.6 质粒转化
• 2.2.5.7 质粒DNA 的小量制备
• 2.2.5.8 大批量质粒DNA 的制备
• 2.2.5.9 定点突变
• 2.2.5.10 细胞培养
• 2.2.5.11 原核系统蛋白质表达和纯化
• 2.2.5.12 脂质体法转染
• 2.2.5.13 磷酸钙法转染
• 2.2.5.14 细胞裂解液的制备
• 2.2.5.15 GST pull-down 实验
• 2.2.5.16 免疫沉淀
• 2.2.5.17 蛋白质降解实验
• 2.2.5.18 蛋白质Western 印迹法
• 2.3 结果
• 2.3.1 基于GPS 2.2 算法的GPS-BeTrIP 1.0 的开发
• 2.3.2 GPS-BeTrIP 1.0 预测结果的实验验证
• 2.4 讨论
• 第3章 原核生物类泛素化的生物信息学预测
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 数据收集和整理
• 3.2.2 GPS 2.2 算法
• 3.2.3 统计性显著分析
• 3.2.4 性能评估
• 3.2.5 在线服务和程序包下载
• 3.3 结果
• 3.3.1 PUP 保守性的分析
• 3.3.2 基于GPS 2.2 算法的GPS-PUP 1.0 的开发
• 3.3.3 预测性能比较
• 3.3.4 Pupylation 位点的大规模预测以及底物的统计显著性分析
• 3.4 讨论
• 第4章 参考文献
• 第5章 致谢
• 第6章 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果