低分子量透明质酸超声—化学制备的基础及实验研究

论文摘要

低分子量透明质酸与透明质酸寡糖以其独特的良好穿透性,优异的生物学相容性,易于组装等特点,在人体内有促血管生成,免疫调节等作用,逐渐成为药物载体与材料研究的热点。现有降解高分子透明质酸的方法主要有化学法,物理法和酶解法。酶解法可以得到分子量分布窄,分子量低的透明质酸,但由于透明质酸酶价格昂贵,且无法回收利用,不利于大规模工业生产;而化学法及物理法制备的透明质酸分子量高,且分子量分布宽,也不能制备可用于临床的产品。本文结合低分子量透明质酸的研究进展,基于粘度法分析相对分子量,重点研究影响化学降解法和物理降解法的关键因素,构建了预测与评价超声和化学法降解透明质酸的动力学模型,并建立了多重超声-化学联合降解法,同时建立了液相色谱分析低分子量透明质酸的方法,为低分子量透明质酸的开发与应用奠定了基础。①为了研究化学降解和物理降解的关键因素,实验建立了通过粘度测定法测定粘均分子量的变化,评价化学和物理降解透明质酸的方法。首先,实验发现高温和pH值对于化学法降解透明质酸的影响明显,在高于25℃条件下透明质酸在8小时内快速降解,而低温反应相对缓慢,但反应进行较充分。只有温度为4℃时,24h降解后最终相对分子量小于100kDa。其次pH值是否大于9对于化学降解透明质酸影响显著,强碱性会明显加快反应。再次,在不同含量氧化剂条件下降解透明质酸,发现氧化剂对于降解的影响十分显著。在反应4h时,氧化剂使用量8mL较使用量1mL的组分,相对分子量相差2.60倍;在24h时,二者相差3.48倍。在超声降解中,实验发现温度对于超声法降解透明质酸的影响较小,降解曲线近似,且最终分子量基本相同。最后,透明质酸在不同频率条件下降解,发现在300kHz到1.7MHz区间,降解的反应速率随超声频率升高而加快,其极限分子量随频率的升高而降低。实验证明氧化剂与酸碱度是化学降解的关键因素,而当pH大于9,化学降解的关键因素为氧化剂含量;对于超声降解,关键影响因素为超声频率。②为了预测与评价超声和化学降解透明质酸,研究在Rice-Herzfeld理论上建立动力学模型,并对模型进行验证。在化学与超声降解中,实验均发现自由基含量均在反应中其最重要作用,因此假设忽略热效应,并认为自由基反应为瞬间反应,无副反应发生的条件下,建立了由自由基主导的链式反应模型。通过对反应速率的微分法推导,证明了在已知相对分子量与时间的条件下,极限分子量与自由基活化速率有对应关系。为了表征反应速率,实验通过HPLC检测水杨酸分解,使用外标法计算2,3-DHBA含量进而得到自由基含量,并且计算活化反应速率。将理论值与实验值进行比较,发现二者偏差值在20%以内,证明建立的动力学模型可以预测反应进行速率和极限分子量,可以预测和评价化学和超声降解透明质酸的反应。③为了制备分子量低,分子量分布窄的透明质酸,研究建立了多重超声-化学联合降解透明质酸的方法。实验建立了使用不同频率的超声震子同时降解透明质酸的多重超声降解法,并比较了单一源超声和多源超声的相对分子量。结果表明多重超声可以迅速降解大分子,最终分子量在10kDa水平,证明高频与低频联合使用的多重降解更有效。优化超声法和化学法的条件,发现4℃,pH范围9.0-10.0,双源超声（1.7MHz和800kHz）,降解8小时可以得到低于10kDa低分子量透明质酸,24小时透明质酸相对分子量低于5kDa,达到透明质酸寡糖级别。红外光谱分析说明透明质酸的结构并未发生改变。使用动力学模型评价极限分子量和反应速率,实验值与理论极限分子量偏差为6.4%,证明反应进行较为完全。④为了分析低分子量透明质酸的分子量分布,研究建立了高效液相色谱法检测低分子量透明质酸的方法。液相条件选择为:色谱柱SHISEIDO CAPCELL PAK NH2:5μm,4.6×250mm;UV,210nm吸收;A相0.1N NaH2PO4,B相H2O;1mL/min流速;梯度:B%:100（0）→0（60min）;进样量,20μL。使用凝胶色谱法与液相色谱法进行谱图比较,结果表明,使用液相色谱可以有效的分析及分离低分子量透明质酸,其方法有经济,灵敏度高的特点。通过液相谱图和凝胶谱图的分析,进一步证明了超声-化学降解法可以快速,有效地得到低分子量透明质酸和透明质酸寡糖。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 课题的提出
• 1.2 研究内容
• 1.3 研究的目的
• 1.4 技术路线
• 2 透明质酸的化学降解
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 温度对化学降解透明质酸的影响
• 2.3.2 pH 对化学降解透明质酸的影响
• 2.3.3 氧化剂量对化学降解透明质酸的影响
• 2.4 讨论
• 3 透明质酸的超声降解
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 频率对超声降解透明质酸的影响
• 3.3.2 温度对超声降解透明质酸的影响
• 3.3.3 多重超声与单一超声的比较
• 3.4 讨论
• 4 透明质酸降解的动力学模型
• 4.1 引言
• 4.2 反应模型的建立及假设
• 4.3 数学公式的推导
• 4.4 HPLC 检测自由基
• 4.4.1 材料
• 4.4.2 方法
• 4.4.3 实验结果
• 4.5 模型的验证
• 4.6 讨论
• 5 超声-化学联合降解方法
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 超声-化学联合制备低分子量透明质酸
• 5.2.3 超声-化学联合降解的理论评价
• 5.2.4 低分子量透明质酸的初步分离
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 超声-化学联合降解实验结果
• 5.3.2 理论评价结果
• 5.3.3 初步分离实验结果
• 5.4 讨论
• 6 低分子量透明质酸的色谱分析方法
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 HPLC 检测透明质酸实验结果
• 6.3.2 凝胶色谱检测透明质酸实验结果
• 6.4 讨论
• 7 结论及后续工作建议
• 7.1 主要的研究内容和结果
• 7.2 不足和后续工作建议
• 8 文献综述
• 8.1 低分子量透明质酸的生物活性
• 8.1.1 多种组织的构成
• 8.1.2 促进血管生成
• 8.1.3 促进伤口愈合
• 8.1.4 与肿瘤的作用
• 8.2 低分子量透明质酸的载体研究
• 8.2.1 非金属元素载体
• 8.2.2 作为金属元素载体
• 8.2.3 雷帕霉素载体
• 8.2.4 紫杉醇载体
• 8.3 低分子量透明质酸的制备研究
• 8.3.1 化学降解
• 8.3.2 物理降解
• 8.3.3 酶降解
• 8.4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录