MHCⅠ类分子和白细胞介素17对天然免疫应答的调控作用及其机制研究

论文摘要

人类生存的环境中存在大量的病原微生物——病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫,而机体在这样的环境中能够抵御这些病原体的侵扰并维持自身稳定,在很大程度上依赖于机体的免疫系统。无论是天然免疫系统还是获得性免疫系统,在机体的抗感染免疫中都起到至关重要的作用,其中,Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）以及TLR触发的天然免疫应答反应是免疫系统识别和清除病原体极为重要的机制。作为最重要的一类模式识别受体（Pattern recognition receptors, PRRs）,TLRs主要表达于巨噬细胞和树突状细胞（Dendritic cells, DC）表面,在各种生物体内高度保守,能够选择性的识别病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns, PAMPs）,构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道防线。为了更好的达到有效清除病原体而同时又不因过度的炎症反应导致机体免疫损伤,TLR信号通路又受到多种其它分子和信号通路的精密调控,但目前对于TLR信号通路调控的细胞与分子机制的研究尚不完全明了,有待于进一步深入研究。对天然免疫信号调控网络的研究对于全面认识免疫系统和抗御外界病原体侵袭具有重要的理论意义和应用价值。MHC I类分子在免疫系统的发育和功能中起着重要的作用,其经典功能是在内质网结合9-11个氨基酸的短肽,然后转运到膜表面,将此短肽抗原通过TCR递呈给CD8+ T细胞。MHC I类分子的缺失会影响CD8+T细胞在胸腺的阳性选择,导致CD8 +T细胞发育障碍。近年来一些研究表明MHC I类分子还具备非经典功能,尤其在交联MHC I类分子后能够在特定细胞介导逆向传递信号,触发一定的生物学效应,包括细胞增殖、凋亡、活化等。考虑到MHC I类分子在几乎所有有核细胞表面都有不同程度表达,它的表达或者激活的逆向信号对于TLR配体触发的巨噬细胞天然免疫反应具备怎样的调控作用?目前尚不清楚。（问题1）MHC I类分子的异常表达对于自身免疫性肌炎（autoimmune myositis）、I型糖尿病以及炎性肠病等一些自身免疫性疾病的发生起到关键作用,而近年来Th17细胞被认为参与多种自身免疫性疾病的发生,这两者之间是否存在一定的关联还未有报道。白细胞介素17 （interleukin 17, IL-17）作为Th17细胞最重要的功能因子能否导致MHC I类分子的表达异常,抑或MHC I类分子的表达异常导致了IL-17的分泌增多?目前尚不明确（问题2）MHC I类分子的经典功能主要包括递呈抗原以激活CD8+ T细胞,以及通过抑制性NK受体维持NK细胞的自身耐受。如若IL-17能够调节MHC I类分子的表达,这就提示我们很有可能IL-17对于机体CD8+T细胞和NK细胞的正常功能具备一定的调控效应。以往对于IL-17的研究局限在对于天然免疫系统的中性粒细胞的募集和趋化,对IL-17非经典功能的研究将有助于我们更加全面的认识机体抗感染免疫精细的调控网络。T细胞是机体获得性免疫的重要组成部分,而CD8+T细胞更是机体抵御胞内菌和病毒感染以及杀伤突变肿瘤细胞的主要效应细胞,其免疫应答的强弱直接关系到机体的健康状态。CD8+T细胞的激活首先需要相应的抗原递呈细胞MHC I类分子提供第一信号,而这些APC本身表达的一些共刺激分子如CD80、CD86等提供第二信号,共同触发CTL的活化和增殖。在固有免疫中,IL-17可以通过促进CXC家族趋化因子（如CXCL8,CXCL1,CXCL10等）以及细胞因子（如IL-6,GM-CSF等）分泌,趋化并激活中性粒细胞从而发挥保护作用。近来有研究表明IL-17在DTH反应和Th1细胞导致的IBD中发挥作用,暗示其很有可能也参与到获得性免疫应答,然而IL-17对于获得性CD8+ T细胞免疫应答到底具有怎样的调控作用?MHC I类分子在其中发挥怎样的功能以及在感染情况下IL-17的细胞来源是什么?目前尚未见报道（问题3）。NK细胞作为机体抵御病原体入侵的第一道防线,是天然免疫中不可或缺的一部分,也是机体抵御肝炎病毒感染的重要细胞组分之一。MHC I类分子在NK细胞的成熟和自身耐受的形成中发挥重要的作用。NK细胞的过度的活化也是导致肝炎重症化的原因之一,因此精确的调控NK细胞的功能对于肝炎的致病机制和临床治疗都有着重大的意义。在慢性乙型肝炎患者血清中IL-17的水平高于正常对照,而在慢性重症乙型肝炎患者血清中检测到更高的IL-17,提示IL-17可能参与肝炎及肝炎重症化的发生。IL-17可以激活多种实质细胞和髓系淋巴细胞,但其对NK细胞的作用目前尚不是很明确。（问题4）基于以上分析与思考,我们对所提出的四个科学问题及其之间可能存在的内在联系进行了系统的研究,分别探讨了MHC I类分子逆向信号在TLR触发天然免疫中的调控;IL-17对MHC I类分子的调控;以及IL-17、MHC I对CD8+ T细胞和NK细胞的调控功能,其研究目的是力图更加深刻地理解MHC I类分子、IL-17在机体免疫系统中复杂的交互作用,更加详细地了解机体复杂的免疫应答过程,为感染性疾病的致病机制以及治疗提供新的线索和实验基础。MHC I类分子逆向信号负向调控TLR触发的巨噬细胞反应及其机制研究既往研究发现,T细胞缺陷的裸鼠对小鼠肝炎的抵抗能力要弱于野生型对照,这些小鼠死于感染早期过度的炎症风暴,提示T细胞可能对天然免疫细胞有某种抑制作用。我们研究了CD8+T细胞在其中的作用。与野生型小鼠相比,MHC I缺陷小鼠对TLR配体LPS、PolyI:C和CpG的刺激以及大肠杆菌的感染更加敏感,而且在早期抵抗李斯特菌感染的能力也要强于野生对照。采用野生和缺陷的造血干细胞在重建致死量照射过的小鼠,发现采用缺陷小鼠骨髓重建的受体小鼠也对于TLR配体的刺激敏感,提示是造血细胞表面表达的MHCI类分子在其中发挥主要作用。利用脂质体剔除内源性的巨噬细胞后,分别回输两种巨噬细胞,发现单纯巨噬细胞的差异既可以使受体小鼠表现出对TLR刺激反应的差异。这些结果表明巨噬细胞表面表达的MHC I类分子在机体抗感染效应中起到重要调节功能。机体内MHC I类分子的天然配体主要为NK细胞表面的抑制性受体,以及CD8+T细胞表面的CD8/TCR分子。在体内利用单克隆抗体剔除了CD8+T细胞或者NK细胞都能够使得机体对TLR配体的反应性增强。在体外,在巨噬细胞培养体系中加入CD8+T细胞,能够明显抑制TLR配体触发的应答,而加入NK细胞未见此效果。用Transwell隔开T细胞和巨噬细胞后,此抑制作用消失,同样CD8+T细胞对MHC I缺失的巨噬细胞却没有抑制效应,提示T细胞发挥抑制效应是接触必须的而且依赖于巨噬细胞表面的MHC I类分子。采用MHC I类分子抗体交联腹腔巨噬细胞,在体外模拟MHC I类分子逆向信号,能够下调TLR配体触发的炎性因子TNF、IL-6和I型干扰素的分泌。WB结果也证实NF-κB和IRF3信号通路受到抑制,Erk、Jnk和p38磷酸化也同样减弱。我们推测在TLR配体活化的巨噬细胞,其表面MHC I类分子在被CD8+T细胞交联后,能够招募活化胞膜或者内侧的抑制性受体,从而介导了对TLR通路的负向调控作用,但具体是什么受体以及在MHC I类分子仅有很短的胞内段的情况下这种效应是如何发生的还有待进一步研究。至此,我们发现MHC I类分子在与CD8+T细胞相互作用后,MHC I类分子的逆向信号能够负向调控TLR配体诱导巨噬细胞的活化,使机体炎症反应局限在一定的范围内,从而避免对机体造成严重的病理损伤。白细胞介素17对MHC I类分子表达的调控效应及其机制研究MHC分子的抗原递呈能力与自身免疫性疾病密切相关,其中MHC I类分子的异常表达对于I型糖尿病、炎性肠病以及自身免疫性肌炎等一些自身免疫性疾病的发生发展起到关键的作用。而Th17细胞又在众多自身免疫性疾病中发挥重要功能,在本部分中,我们对IL-17和MHC I类分子间的调控效应做了研究。体外利用IL-17刺激小鼠巨噬细胞或者树突状细胞,24小时后都能够观察到MHC I类分子的上调。IL-17下游的信号通路目前研究的已经比较清楚,IL-17A结合IL-17RA后,通过Act1和Traf6激活下游的MAPK、NF-κB以及C/EBP。既往对IFN-γ上调MHC I类分子表达的机制研究提示Stat1的磷酸化在其中起到关键作用。我们对IL-17在巨噬细胞中的通路做了研究,发现IL-17也能够活化巨噬细胞Stat1信号,继而从机制上解释了对MHC I类分子的调控。不仅如此,IL-17还能够跟LPS协同作用,进一步上调MHC I类分子表达,提示我们IL-17可能参与CD8+ T细胞的活化和增殖,在获得性T细胞免疫的调控中发挥一定效应。白细胞介素17对抗感染CTL应答的调控及MHC I分子在其中的作用机制研究我们首先采用李斯特菌感染感染野生型小鼠,用定量PCR和ELISA的方法发现小鼠脾脏和血清中的IL-17表达能够迅速上升,并在第5天达到高峰,随后逐渐下降,提示其可能发挥一定的生物学功能。继而选用了IL-17缺陷小鼠,发现李斯特菌在缺陷小鼠体内的清除明显减慢,但是这一现象并不能够用中性粒细胞募集缺陷简单的解释。因为CTL的形成在李斯特菌感染的彻底清除中是必不可少的,于是我们采用流式细胞仪对两种感染小鼠体内的T细胞反应进行了测定。结果发现在IL-17缺陷小鼠体内CTL的数量明显少于野生型对照,但是CD4+T细胞却没有明显差异。通过CFSE体内示踪,我们发现,IL-17能够促进CD8+T细胞的增殖,但是并不能直接作用于CD8 +T细胞。从体外研究中我们发现,IL-17通过作用于树突状细胞间接作用到T细胞。IL-17刺激后的树突状细胞能够上调MHC I类分子的表达,并且分泌更多量的炎性因子IL-12、IL-6、IL-1等,但是对其他共刺激分子以及树突状细胞的吞噬功能都没有明显影响。这一结论从体内也得到了验证:从IL-17缺陷小鼠脾脏分离得到的树突状细胞分泌较少的IL-12,激发OT-I细胞增殖的能力也明显弱于野生型。接下来我们又研究了体内IL-17的来源,发现感染后不是通常的Th17细胞,而是一群γδT细胞是IL-17的主要分泌细胞。过继回输野生型的γδT细胞能够部分逆转IL-17缺陷小鼠的血清IL-17水平和CTL反应,而回输IL-17缺陷的γδT细胞或者野生型CD4+T细胞都没有此效应,进一步证实了γδT细胞分泌的IL-17在激发抗感染的CTL反应中的正向调控作用。我们的研究表明,在李斯特菌感染后能够诱导一群特定的γδT细胞分泌IL-17。IL-17通过作用于树突状细胞,促进其交叉提呈能力,从而激发更为强烈的杀伤性T细胞反应,在机体抗李斯特菌感染的免疫反应中发挥重要作用。对抗肿瘤生物治疗也存在一定指导意义。白细胞介素17对NK细胞介导的肝炎的调控作用及机制在人类肝炎血清中检测到IL-17的上升,并且与疾病严重程度呈正比,提示IL-17在病毒性肝炎中的致病作用。我们采用PolyI:C联合D-galN诱导的急性肝炎为模型,发现Il17a-/-小鼠的存活能力要远远高于野生对照,与其对应的是血清中较低的谷丙转氨酶和谷草转氨酶,病理结果也证实野生小鼠肝脏细胞空泡形成和凋亡要比缺陷小鼠明显。通过对两种小鼠肝脏浸润淋巴细胞分析,我们发现Il17a-/-小鼠中NK细胞在肝脏的聚集明显受到抑制,而且即使是募集来的NK细胞其活化性标记CD69的表达也远远低于野生对照。体外研究发现,NK细胞也表达IL-17RA,但是IL-17信号对NK细胞的存活并没有影响,也不能活化NK细胞,但是能够协同PolyI:C激活下游NF-κB转录因子,以及MAPK信号通路,使得NK细胞对YAC-1和原代肝细胞杀伤能力增强,从而可能解释在IL-17存在的情况下PolyI:C激发的肝炎要更加严重。利用细胞因子胞内染色技术,我们发现PolyI:C诱导肝炎过程中,肝脏中IL-17的主要来源是γδT细胞和NKT细胞。同样,我们也检测了Kupffer细胞在其中的作用,利用脂质体或者Gdcl3剔除肝脏Kupffer后,再注射PolyI:C,发现血清中IL-17水平明显下降,提示巨噬细胞参与IL-17的诱导产生和肝炎发生。PolyI:C可以刺激巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、IL-23等,这些细胞因子能够促使γδT细胞分泌IL-17,继而影响了NK细胞的活化。过继回输野生型的γδT细胞到Il17a-/-小鼠体内,能够一定程度上加重肝脏损伤。我们的研究表明,PolyI:C或者病毒感染机体后,在通过TLR3活化NK细胞的同时,能够诱导肝脏中的固有免疫γδT和NKT细胞分泌IL-17,协同增强NK细胞活化,加重NK对肝细胞的毒性作用,从而加重肝损伤。Kupffer可能也通过分泌相关细胞因子参与了γδT细胞IL-17诱导这一过程。此发现有助于阐明病毒性肝炎重症化的机制及免疫调控新方法的建立有重要意义。总之,通过以上四部分实验内容,我们研究了CD8 +T细胞通过MHC I类分子调控TLR激发的巨噬细胞应答及其机制,以及天然免疫细胞分泌的IL-17对CD8+T细胞和NK细胞的调控,证明了IL-17对天然免疫和获得性免疫的促进作用,同时也发现获得性免疫的CD8+T细胞可以通过MHC I逆向信号影响天然免疫应答。该研究结果拓宽了人们对于MHC I类分子以及IL-17的性质与功能的认识,丰富了TLR免疫识别及其调控机制的研究内容,也有望为免疫相关疾病发病机制的研究与治疗方法的寻找提供新的启示。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 MHC I 类分子对TLR 配体触发的天然免疫应答的调控作用及其机制研究
• 第二部分 白细胞介素17 对MHC I 类分子的调控作用及其机制研究
• 第三部分 白细胞介素17 对抗感染CTL 应答的调节功能和MHC I 类分子在其中的机制研究
• 第四部分 白细胞介素17 对NK 细胞介导的爆发性肝炎的调控作用及其机制研究
• 小结
• 参考文献
• 文献综述 MHC I 类分子的非经典作用及其信号机制研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况
• 致谢