猪DGAT2基因3’-UTR区的多态性鉴定及功能初步分析

论文摘要

DGAT2（乙酰辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶,diacylglycerolacyl transferase,DGAT）是属于酰基辅酶A单酰甘油酰基转移酶（MGAT）家族中的一员,催化能量分子甘油三酯合成的最后一步反应并对其限速,这步反应使二酰甘油（diacylgycerol,DAG）加上脂肪酸酰基辅酶A以共价键结合形成三酰甘油（TG）。DGAT2的表达调控可能控制着动物体内脂肪合成进而影响肉质等生产性状。本研究采用克隆测序的方法寻找DGAT2基因3′-UTR区的多态性,在包括279头约克夏、96头长白、190头杜洛克、95头鲁莱黑猪、37头莱芜猪、57头大蒲莲和141头军牧一号在内的猪群中检测PS905位点13bp插入/缺失的多态性分布,对有生产性能记录的141头军牧一号猪群体进行基因型与性状数据的关联分析,最后通过生物信息学分析和在细胞水平检测构建的不同基因型3′-UTR载体pGL3-LUC-A和pGL3- LUC-B对报告基因表达的影响,分析PS905位点13bp插入缺失多态的生物学功能。研究结果如下:（1）DGAT2基因3′-UTR区终止密码子之后905bp（PS905）处有一个13bp（TCCTCTGACCTGC）的插入/缺失多态。（2）在所检测的约克夏、长白、杜洛克、鲁莱黑、莱芜猪、大蒲莲、军牧一号群体中AA型均为优势基因型,χ2检测显示所有的猪种该位点均处于哈代温伯格平衡状态。A等位基因频率变化趋势为:地方猪种>育成品种>西方品种。（3）在军牧一号猪群体中,AA基因型的校正背膘厚大于AB基因型,差异极显著（P<0.01）;瘦肉率小于AB型,差异显著（P<0.05）。（4）不同类型3′-UTR荧光素酶载体的转染结果表明:pGL3-LUC-B型荧光素酶活性与pGL3-LUC-A但是差异不显著（P=0.0672）,B型略高。（5）3′-UTR的RNA二级结构预测结果表明A型的最小自由能更小,更加趋于稳定。综上所述,DGAT2基因3′-UTR区PS905位点13bp插入型为优势基因型,数据关联分析表明此位点与背膘厚和瘦肉率数据显著相关,AA基因型趋于使背膘增厚,瘦肉率下降。瞬时转染实验显示的结果显示pGL3-LUC-A型载体表达较低,这与数据关联分析结果一致。该位点对于脂肪沉积的影响有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 DGAT2 基因的研究进展
• 1.1.1 DGAT2 基因的发现
• 1.1.2 DGAT2 基因的定位和结构
• 1.1.3 DGAT2 蛋白特性及表达
• 1.1.4 DGAT2 的生理功能
• 1.1.5 DGAT 与瘦素和胰岛素的关系
• 1.1.6 DGAT2 的多态性研究
• 1.1.6.1 牛DGAT2 基因的研究
• 1.1.6.2 禽DGAT2 基因的研究
• 1.2 其它影响脂肪沉积的基因研究进展
• 1.2.1 参与脂肪代谢的基因
• 1.2.1.1 FABP 家族蛋白
• 1.2.1.2 苹果酸酶1（ME1）基因
• 1.2.1.3 激素敏感脂酶（hormone-sensitive lipase, HSL）基因
• 1.2.1.4 脂蛋白酶（lipoprotein lipase , LPL）基因
• 1.2.2 调节脂肪生成的基因
• 1.2.2.1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ）
• 1.2.2.2 固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1c）
• 1.2.2.3 瘦素基因（Leptin）
• 1.2.3 3′-UTR 功能研究概述
• 1.2.4 调节转录本的稳定性
• 1.2.4.1 AREs 介导的mRNA 降解
• 1.2.4.2 通过保护断裂位点（cleavage site）而稳定mRNA
• 1.2.5 翻译调控
• 1.2.6 控制mRNA 的亚细胞定位
• 1.2.7 编码功能的调控
• 1.2.8 与疾病的关系
• 1.2.9 与微小RNA（microRNA，miRNA）的相互作用
• 1.3 目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物和样品采集
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 主要数据库及生物软件
• 2.1.5 培养基、缓冲液与常用试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试验中用到的所有引物序列
• 2.2.2 猪DGAT2 基因3′-UTR 区多态位点寻找
• 2.2.2.1 确定DGAT2 基因3′-UTR 的范围
• 2.2.2.2 克隆测序法寻找潜在多态位点
• 2.2.3 DGAT2 基因 PS905 位点基因多态性群体检测
• 2.2.4 DGAT2 基因3′-UTR PS905 位点13bp 插入/缺失多态与背膘厚等性状的关联分析
• 2.2.4.1 军牧一号猪的基因型检测
• 2.2.4.2 15%PAGE 胶鉴定DGAT2 基因3′-UTR 位点PS905 基因型
• 2.2.4.3 与生产数据关联分析
• 2.2.5 不同基因型3′-UTR 载体的克隆转化测序
• 2.2.5.1 PCR 扩增
• 2.2.5.2 将目的片段连入pGL3-promoter 载体
• 2.2.6 猪DGAT2 基因3′-UTR 2 种载体的去内毒素处理
• 2.2.6.1 去内毒素质粒的提取
• 2.2.6.2 提取质粒浓度和质量鉴定
• 2.2.7 细胞转染及荧光素酶活性的测定
• 2.2.7.1 小鼠3T3-L1 细胞系的培养及诱导分化
• 2.2.7.2 用构建的2 种单倍型载体转染小鼠3T3-L1 细胞
• 2.2.7.3 双荧光素酶活性的测定
• 2.2.8 不同类型3′-UTR 的生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 DGAT2 基因3′-UTR 区的PCR 扩增及加A 位点确定
• 3.2 猪DGAT2 基因3′-UTR 区克隆测序寻找多态位点结果
• 3.3 猪DGAT2 基因3′-UTR 区PS905 位点多态群体检测结果
• 3.4 猪DGAT2 基因3′-UTR 区PS905 位点多态与军牧一号猪种生产性状的关联分析
• 3.4.1 军牧一号猪基因组提取
• 3.4.2 军牧一号生产数据处理结果
• 3.4.2.1 数据校正
• 3.4.2.2 表型数据分析
• 3.4.3 基因型与性状关联分析
• 3.5 不同类型3′-UTR 载体构建及细胞转染结果
• 3.5.1 不同类型基因3′-UTR 的PCR 扩增与回收
• 3.5.2 猪DGAT2 基因3′-UTR 区2 种载体的鉴定结果
• 3.5.3 不同载体转染效率的比较
• 3.6 不同3′-UTR 生物信息学分析
• 4 讨论
• 4.1 DGAT2 基因3′-UTR 多态与生产性状关系的研究
• 4.1.1 DGAT2 基因与脂肪沉积的关系
• 4.1.2 DGAT2 基因多态的研究
• 4.1.3 DGAT2 基因3′-UTR 区多态分布分析
• 4.2 下一步的工作
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评