论文摘要
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是生物体内重要的中间代谢物质，参与了40多种生化反应，从基因的表达，细胞膜的流动到多肽的合成等等。临床研究表明，SAM对关节炎，抑郁症，肝功能紊乱等均有较好的疗效，而且还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物。我国肝炎患者相当多，且随着生活节奏的增快，抑郁症和关节炎患者也不断增多，S-腺苷甲硫氨酸在国内存在广阔的市场。而至今国内S-腺苷甲硫氨酸的研究还没有工业化，虽然有国外商品供应，但价格昂贵无法普及。因此国内开发高产廉价的S-腺苷甲硫氨酸生产工艺显得极为迫切。 本论文完成了酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（sam2）的克隆及原核表达。以酿酒酵母2B-41的染色体DNA为模板，根据GenBank上登陆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（登录号M23368）设计特异性引物进行PCR扩增，获得大约1200bp的DNA片段。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆到pUCm-T载体中，构建重组质粒pUCm-T- sam2，转化E．coli DH5 α，经蓝白斑筛选、菌落PCR及质粒的双酶切筛选出2个阳性克隆。选取一个阳性克隆测序，并用Blast软件进行序列分析。分析结果表明，该序列与Genbank中登录的sam2基因同源性为99％，氨基酸序列一致性为100％。 以EcoR I／XhoI双酶切经测序正确的重组质粒pUCm-T-sam2和表达载体pET-28a（+），并将纯化后的sam2连接至pET-28a（+），构建表达载体pET-sam2。将pET-sam2转化E.coli BL21（DE3）。重组菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达外源蛋白分子量约为47KD，与预期分子量相符。同时研究了不同IPTG浓度、不同诱导温度对蛋白表达水平的影响，发现IPTG浓度对SAM的表达量影响不大，低温不利于表达。测定酶活为0.0237U／mL。
论文目录
第一章 绪论1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能1.1.1 S-腺苷甲硫氨酸在体内的代谢循环1.1.2 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能1.2 S-腺苷甲硫氨酸的应用1.3 S-腺苷甲硫氨酸生产的研究历史及现状1.3.1 S-腺苷甲硫氨酸生产工艺的研究1.3.1.1 化学法生产SAM的研究1.3.1.2 微生物发酵法生产SAM的研究1.3.1.3 酶促转化法生产SAM的研究1.3.2 S-腺苷甲硫氨酸稳定性研究1.3.2.1 S-腺苷甲硫氨酸失活机理1.3.2.2 S-腺苷甲硫氨酸稳定性盐的开发1.3.3 S-腺苷甲硫氨酸的提取、分离纯化及测定1.3.3.1 S-腺苷甲硫氨酸的提取及分离纯化1.3.3.2 S-腺苷甲硫氨酸的测定1.4 论文的立题背景及研究内容第二章 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆2.1 实验材料2.1.1 实验仪器2.1.2 载体与菌株2.1.3 酶及主要试剂2.1.4 培养基2.2 实验方法2.2.1 酿酒酵母基因组DNA的提取2.2.1.1 主要缓冲液和溶液2.2.1.2 酿酒酵母基因组DNA的提取方法2.2.2 琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA2.2.3 PCR扩增目的基因sam22.2.3.1 引物的设计与合成2.2.3.2 PCR反应条件2.2.3.3 PCR反应产物的纯化2.2.4 重组载体pUCm-T-sam2构建及转化2.2.4.1 克隆载体pUCm-T-sam2的构建2.2.4.2 pUCm-T-sam2的转化2.2.4.3 重组子的筛选和初步鉴定2.3 结果与讨论2.3.1 基因组DNA的提取2.3.2 PCR反应2.3.3 菌落PCR筛选阳性克隆2.3.4 阳性克隆的酶切鉴定2.3.5 目的基因序列测定及结果分析2.4 小结第三章 SAM合成酶基因表达载体的构建及表达3.1 实验材料3.1.1 实验仪器3.1.2 载体及试剂3.2 实验方法3.2.1 表达载体pET-sam2的构建及转化3.2.2 sam2的诱导表达3.2.2.1 sam2基因的诱导表达3.2.2.2 SDS-PAGE电泳检测表达结果3.2.2.3 不同条件对表达的影响3.2.3 SAM合成酶酶活的测定3.3 结果与讨论3.3.1 PCR初步筛选阳性菌株3.3.2 阳性克隆的酶切鉴定3.3.3 诱导时间对表达量的影响3.3.4 IPTG浓度对表达量的影响3.3.5 温度对表达量的影响3.3.6 SAM合成酶酶活测定结果3.4 小结第四章 结论参考文献附录致谢研究成果及发表的学术论文导师和作者简介
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标签：酿酒酵母论文; 腺苷合成酶基因论文; 克隆论文; 表达论文;
酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达研究
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