影响食品安全的食源性致病菌快速检测技术与风险分析研究

论文摘要

食品安全问题一直是各国政府和人民群众最为关心的问题,它关系到消费者的健康和生命。由病原细菌引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。因此对食源性致病菌快速、准确的检测问题亟待解决。本研究针对在食品微生物污染中比较常见的致病菌,开展了以分子免疫学、分子生物学为基础的检测技术改进与应用研究,采用胶体金免疫层析法,常规PCR法、实时荧光PCR法、高通量基因芯片法对食源性致病菌进行检测的系统研究,并把这些检测技术首次应用于进出境商品的鉴定检测,获得了成功。首次系统地建立了国内外第一个食源性致病菌的检测技术体系,该体系的成功建立,极大的提高了进出境食品的检验效率,缩短了检验时限,对突破国外对我国设置的技术贸易壁垒起到了关键作用。利用胶体金免疫层析技术,对金黄色葡萄球菌A、B型肠毒素,单增李氏菌溶血素O进行了快速检测的研究,开发了具有我国自主知识产权的葡萄球菌肠毒素和单增李斯特菌及李斯特菌溶血素胶体金检测试剂条,建立了一套方便现场使用并且容易操作的检测方法。该方法特异性强,不需任何附加设备,检测时间大为缩短,灵敏度高。为食源性致病菌的前期快速筛选做好了技术储备。通过常规PCR技术对食品中常见的病原细菌进行了快速检测的试验结果表明,应用PCR方法可以很好的对食品中的食源性病原菌进行检测,仅用几个小时即可完成检验过程,大大的缩短了检测时间。对于缩短进出境货物通关时间具有十分重要的意义。本研究采用实时荧光PCR技术,针对沙门氏菌等食品中常见的致病菌,通过检索文献,确定致病菌的靶基因序列,利用生物软件进行序列对比,截取最一致的序列进行引物探针设计,并筛选出适合实时荧光PCR检测的特异性探针,建立了沙门氏菌等11种食源性致病菌的实时荧光PCR技术,并研制出了适合于进出口检验检疫、疾病控制、临床诊断及产品质量检验使用的试剂盒。通过实时荧光PCR法检测食源性致病菌与国家标准、行业标准方法的比较,检出率完全相同,显示出该方法具有广泛而良好的适用性,对于11种食源性致病菌的检测限度可以达到84 cfu/mL-7000 cfu/mL之间完全满足检验检疫业务的需要。并且首次在DNA模板的制作过程中做出了平板菌落煮沸法的尝试,节省了试验步骤,取得了较好试验效果。在基因芯片高通量检测食源性致病菌的研究中,优化出反应体系的9条探针及引物位点,并使多重PCR能够做到多重引物的同时扩增,克服了多重PCR反应条件优化过程中各引物之间的相互干扰,以及引物、探针荧光标记产物的长度和结构之间等存在的相互干扰等技术难点,确定了55℃为最适合杂交温度以及最佳杂交液配置方案,从而建立了基于多重PCR技术的高通量检测食源性致病菌的基因芯片检测技术。对丹东口岸入境的十种冷冻水产品引起李斯特菌病、四种冷冻水产品引起沙门菌病和六种冷冻水产品引起副溶血性弧菌胃肠炎疾病的风险进行评估。建立了定量食源性致病菌危险性评估模型,结果表明:单次消费经丹东口岸进口的冷冻章鱼、海螺、青柳蛤肉、香螺、江瑶贝、蟹子、河虾、河螺肉、紫石房蛤和其它贝类,引起李斯特菌病的概率几乎为零,不具有危险性。单次消费经丹东口岸进口的冷冻海螺、河螺肉、香螺和其它贝类,引起沙门菌病的概率,对于正常人群分别为1.57×10-2、7.62×10-3、2.19×10-2和1.62×10-2;对于易感人群分别为0.12、6.61×10-2、0.15和0.12。单次消费经丹东口岸进口的冷冻海螺、章鱼、河螺肉、紫石房蛤、江瑶贝和蟹子,引起副溶血性弧菌胃肠炎的概率,分别为6.21×10-6、6.65×10-7、3.85×10-7、1.26×10-8、1.28×10-6和9.18×10-7。本研究首次建立了食源性致病菌分子免疫学、常规PCR、实时荧光PCR和基因芯片检测以及同国家标准比对的技术体系,这也是国际上首次研究建立的的食源性致病菌的检测技术体系。本研究还在国际上首次对朝鲜进境的冷冻水产品进行了风险评估。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 食品安全检测技术及风险评估研究进展
• 1.影响食品安全的常见的食源性致病菌
• 1.1 金黄色葡萄球菌
• 1.2 单核细胞增生李斯特氏菌
• 1.3 沙门氏菌
• 1.4 志贺氏菌
• 1.5 副溶血性弧菌
• 1.6 空肠弯曲菌
• 1.7 耶尔森氏菌
• 1.8 霍乱弧菌
• 157:H₇'>1.9 肠出血性大肠杆菌O₁₅₇:H₇
• 1.10 创伤弧菌
• 2.食品安全检测应用的现状及存在问题
• 3.食品安全最新检测技术
• 3.1 PCR检测技术
• 3.2 实时荧光PCR技术
• 3.3 生物芯片技术
• 4.食品安全风险评估研究进展
• 4.1 食品安全风险评估的产生与发展
• 4.2 国内外食品风险评估研究现状分析及存在的问题
• 4.3 对进出口食品中微生物危害进行危险性评估的目的及意义
• 4.4 食源性微生物危险性评估的概念与应用
• 4.5 国外食源性微生物危险性评估的研究进展
• 4.6 我国的食源性微生物危险性评估研究进展
• 5.前景展望
• 第二章 胶体金免疫层析技术检测食源性致病菌的研究
• 1.概述
• 2.胶体金免疫层析技术检测食源性致病菌的研究
• 2.1 胶体金免疫层析技术检测A型葡萄球菌肠毒素的研究
• 2.2 胶体金免疫层析技术检测B型葡萄球菌肠毒素的研究
• 2.3 胶体金免疫层析技术检测C型葡萄球菌肠毒素的研究
• 2.4 胶体金免疫层析技术检测单增李氏菌的研究
• 2.5 单增李氏菌溶血素O胶体金检测试纸条的研发
• 3.结论与讨论
• 3.1 抗原抗体的选择
• 3.2 检测的敏感度和特异性
• 3.3 重组蛋白的构建
• 3.4 表达载体的选择
• 第三章 PCR技术检测食源性致病菌的研究
• 1.概述
• 2.材料与方法
• 3.结果与分析
• 4.结论与讨论
• 4.1 引物的设计
• 4.2 PCR反应条件的优化
• 4.3 PCR技术在检测实验性致病菌应用中存在的问题
• 第四章 实时荧光PCR技术检测食源性致病菌的研究
• 1.概述
• 2.实时荧光PCR技术检测食源性致病菌的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果分析
• 2.3 金黄色葡萄球菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.4 小肠结肠耶尔森氏菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.5 单核细胞增生李斯特氏菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.6 空肠弯曲菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.7 肠出血性大肠杆菌O157荧光PCR检测方法的建立
• 2.8 副溶血性弧菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.9 霍乱弧菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.10 创伤弧菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.11 溶藻弧菌荧光PCR检测方法的建立
• 2.12 验证实验
• 2.13 模板DNA的几种不同提取方式的比较试验结果
• 3.结论与讨论
• 3.1 实时荧光PCR检测食源性致病菌引物探针的筛选
• 3.2 实时荧光PCR反应体系的优化
• 3.3 实时荧光PCR检测食源性致病菌DNA模板的制备
• 3.4 实时荧光PCR法检测食源性致病菌与国标、行标方法的比较
• 第五章 基因芯片技术检测食源性致病菌的研究
• 1.概述
• 2.材料和方法
• 3.结论与讨论
• 3.1 设计和筛选特异性探针是建立基因芯片检测技术的关键
• 3.2 基因芯片制备中的质量控制是进行芯片试验和研究的最关键因素
• 3.3 芯片杂交扫描结果的判定标准
• 3.4 利用多重PCR来充分体现基因芯片检测技术的高通量优势
• 3.5 寡核苷酸芯片检测结技术特点
• 3.6 关于寡核苷酸芯片检测技术的敏感性、特异性与重复性的讨论
• 第六章 食源性致病菌风险评估的研究
• 1.概述
• 2.丹东口岸进口冷冻水产品中单核细胞增生性李斯特菌、沙门菌和副溶血性弧菌的定量危险性评估
• 4.结论与讨论
• 第七章 结论与展望
• 1.主要结论
• 2.解决的关键技术问题和创新点
• 3.有待于进一步开展的工作
• 参考文献
• 致谢
• 附录