木贼抗氧化损伤作用的有效部位提取及对人血管内皮炎症反应的干预作用

论文摘要

目的:前期动物实验研究证实中药木贼水煎剂和正丁醇提取物（脂溶部分和水溶部分）具有调节脂代谢,保护血管内皮,改善动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）早期病变的作用,但对离体人血管内皮是否有同样的保护作用,尚未观察,本实验在前期实验的基础上,对木贼抗AS的有效部位进行提取分离,旨在观察木贼提取物对ox-LDL致人血管内皮细胞炎症反应的干预作用,从分子水平和基因表达调控水平深入探讨木贼抗氧化损伤的药理活性部位及作用机制。方法:第一部分1木贼有效部位的提取称取一定质量的中药木贼,用体积为12倍木贼质量的70%乙醇于圆底烧瓶中浸泡2小时后,电热套小火加热,回流提取三次,每次两小时,将提取液滤纸过滤,并收集混匀,即得到木贼提取液。2木贼有效部位的分离木贼提取液减压浓缩,使其中乙醇完全蒸发并使所剩液体的体积小于大孔树脂的柱体积,将减压浓缩得到的提取液加入处理好的大孔树脂柱中,经水洗脱, 30%乙醇洗脱, 70%乙醇洗脱,收集几次70%乙醇洗脱液得木贼的有效部位。3木贼中有效部位（即总黄酮和总酚酸）含量的计算分别取槲皮素（quercetin）对照品、阿魏酸（ferulic acid）对照品及70%乙醇洗脱液在紫外分光光度计上于200-400nm处扫描,确定波长。分别制备槲皮素标准曲线和阿魏酸标准曲线,并依据标准曲线计算木贼中总黄酮和总酚酸含量。4木贼70%乙醇洗脱液中有效部位（总黄酮和总酚酸）纯度的计算纯度=用紫外分光光度计测得的有效部位的量/提取物净重×100%5木贼提取物培养液的制备将木贼70%乙醇洗脱液减压浓缩。用二甲基亚砜（DMSO）溶解浓缩后的木贼洗脱液,然后用不含血清的低糖DMEM将其分别稀释至1000μg/ml,500μg/ml,250μg/ml,并使DMSO的浓度为5%,56℃,30min灭活,-20℃保存。第二部分1氧化低密度脂蛋白的制备采用化学沉淀法提取低密度脂蛋白（LDL）,考马斯亮蓝法测定其浓度,将LDL置于10μmol/L CuSO4溶液中,37℃避光氧化24h,经PH7.4 PBS透析24h,过滤除菌,得氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）,4℃保存。琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行LDL氧化产物共轭双烯（OD）检测。考马斯亮蓝法测定其浓度。2细胞培养常规方法培养脐静脉内皮细胞,分别设正常对照组、氧化损伤组、木贼提取物高浓度（100μg/ml ）组、木贼提取物中浓度（50μg/ml ）组、木贼提取物低浓度（25μg/ml ）组。观察各组内皮细胞情况。3指标检测收集细胞和培养液后,倒置相差显微镜和扫描电镜观察各组细胞形态变化。硝酸还原酶法和放射免疫分析法分别检测培养液中NO和IL-8含量,化学比色法检测细胞中NOS含量,流式细胞仪检测细胞VCAM-1蛋白表达。提取细胞总RNA,运用半定量RT-PCR的方法,对iNOS、IL-8及VCAM-1 mRNA的表达情况进行分析。结果:第一部分1槲皮素、阿魏酸标准曲线槲皮素标准曲线:y= 0.0150x-0.000774（r=0.989）,阿魏酸标准曲线:y= 0.009877x-0.0002864（r=0.995）,结果表明槲皮素在0.00212～0.00742mg/ml,阿魏酸在0.0016～0.0048mg/ml浓度范围内浓度与吸光度具有良好的线性关系。2木贼中有效部位（总黄酮和总酚酸）含量木贼中以槲皮素计总黄酮含量为1.69 mg/g;以阿魏酸计总酚酸含量为1.23 mg/g;有效部位（总黄酮和酚酸）含量2.92mg/g。3木贼70%乙醇洗脱液中有效部位（总黄酮和总酚酸）纯度计算木贼70%乙醇洗脱液中有效部位的纯度为63.28%,可用于干预细胞。第二部分1正常血清,LDL,LDL氧化产物的电泳图像化学沉淀法所得LDL的琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带,与正常血清中LDL条带处于同一水平。LDL氧化产物琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带,泳动速率较LDL快近一倍。提示LDL的提取及氧化成功。2 LDL氧化曲线3个氧化时相即延迟期、快速反应期、分解期明显,氧化程度于10h左右已达到完全。3倒置相差显微镜下细胞生长状况正常对照组细胞生长良好,细胞饱满,无死亡细胞;氧化损伤组细胞生长较差,细胞瘦小,萎缩,有部分细胞死亡;木贼提取物组细胞生长较好,细胞较饱满,少部分细胞变圆,一般情况好于氧化损伤组。以中浓度组生长状态最好。4内皮细胞扫描电镜的观察结果4.1正常对照组内皮细胞镜下可见细胞分布均匀,形态完整,核区明显,细胞核轮廓清楚,可见小、圆形、大量的分泌小泡位于细胞表面和细胞膜的边缘。4.2氧化损伤组内皮细胞的改变镜下可见细胞膜不清楚,胞膜皱襞明显减少,胞质稀疏,几乎为裸核,核仁清晰,细胞连接轮廓可见,分泌小泡较少,细胞体积缩小,细胞受损严重,核区表面,核仁与胞质交界处有数个大小不等、蚕蚀状的破损,可见部分细胞固缩。4.3木贼提取物组内皮细胞的变化镜下可见细胞体积较氧化损伤组增大,细胞形态完整,胞质较氧化损伤组丰满、致密,细胞核完整,细胞核与胞质间无破损,胞膜表面皱襞增多,分泌小泡较氧化损伤组增多。5培养液NO水平变化氧化损伤组NO浓度较正常对照组明显降低（P<0.01）,木贼提取物高,中,低浓度组NO浓度较氧化损伤组显著升高（P<0.01）。6细胞NOS活性变化氧化损伤组NOS较正常对照组明显降低（P<0.01）,iNOS较正常对照组明显升高（P<0.01）,木贼提取物高,中,低浓度组NOS较氧化损伤组显著升高（P<0.01）,iNOS表达量明显低于氧化损伤组（P<0.01）,用药组间无明显量效关系。7培养液IL-8水平变化氧化损伤组IL-8较正常对照组明显升高（P<0.01）,木贼提取物高,中,低浓度组IL-8较氧化损伤组明显降低（P<0.01）。8细胞VCAM-1蛋白表达量变化氧化损伤组VCAM-1蛋白表达较正常对照组显著升高（P<0.01）。中剂量木贼提取物组VCAM-1蛋白表达较氧化损伤组显著降低（P<0.01）。9细胞iNOS mRNA表达的变化中浓度木贼提取物对人脐静脉内皮细胞iNOS mRNA的表达有明显抑制作用（P<0.01）。10细胞IL-8 mRNA表达的变化中浓度木贼提取物对人脐静脉内皮细胞IL-8 mRNA的表达有明显抑制作用（P<0.01）。11细胞VCAM-1 mRNA表达的变化氧化损伤组的VCAM-1 mRNA表达量显著高于正常对照组（P<0.01）,中浓度木贼提取物组mRNA表达量显著低于氧化损伤组（P<0.01）。结论:木贼提取物能显示出较明显的保护血管内皮细胞,减轻炎症反应,抗AS的作用。这为揭示木贼抗氧化损伤的有效部位和作用机制奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 木贼抗氧化损伤作用的有效部位提取及对人血管内皮炎症反应的干预作用
• 第一部分 木贼抗内皮氧化损伤作用有效部位的提取
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 木贼有效部位对氧化低密度脂蛋白致人血管内皮炎症反应的干预作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历