抗叶酸代谢药MTX诱导神经管畸形动物模型及其对基因组稳定性的影响

论文摘要

目的1、利用抗叶酸代谢药MTX建立神经管畸形小鼠模型。2、研究MTX诱导神经管畸形小鼠胚胎神经组织基因组拷贝数变异以及甲基化的改变。3、观察MTX抑制叶酸代谢对神经管畸形小鼠胚胎神经上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法1、甲氨蝶呤诱导神经管畸形小鼠模型的建立C57BL/6孕鼠在怀孕第7.5天腹腔注射不同剂量的MTX,怀孕第11.5天处死孕鼠,体视显微镜下取出胚胎,观察其发育情况,记录活胎数、死胎数、吸收胎数、畸形胎数,计算畸形率,逐一测量胚胎的体长和体重。将部分正常胚胎和神经管畸形胚胎固定于10%中性福尔马林中。取出固定的全胚胎组织,进行石蜡包埋,连续切片,HE染色,光学显微镜下观察。根据实验结果筛选最佳造模剂量。2、微阵列比较基因组杂交技术检测MTX诱导神经管畸形胚胎神经组织基因组拷贝数变异（CNV）应用高分辨微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）检测正常和神经管畸形胚胎基因组CNV,设定log2 ratio means?0.45;CNVs探针密度?5;长度?10Kb为高可信度CNV标准筛选CNV。并联合RT-PCR和MassARRAY平台对高可信度CNV进行验证,用GO对位于高可信度CNV上的基因进行注释,筛选候选基因。3、全基因组甲基化芯片检测MTX诱导神经管畸形胚胎神经组织基因组甲基化的改变应用全基因组甲基化芯片检测正常和神经管畸形胚胎基因组甲基化的改变。设定peak同时在3个神经管畸形样品都发生改变,且peak的log2 ratio means?0.5为标准筛选高可信度peak,即发生甲基化改变的区域,并对发生甲基化改变的基因进行GO分析,同时用RT-PCR（reverse transcription PCR）方法观察候选基因的表达情况。4、MTX抑制叶酸代谢对神经管畸形小鼠胚胎神经上皮细胞增殖和凋亡的影响应用TUNEL方法观察神经管畸形小鼠胚胎神经管上皮细胞的凋亡情况。应用免疫组化的方法观察pH3蛋白在神经管上皮细胞的表达,从而反映细胞的增殖情况。应用免疫组化和western-blotting的方法检测小鼠胚胎脑caspase3的表达情况。结果1、成功建立了叶酸代谢障碍的神经管畸形动物模型,C57BL/6孕鼠在怀孕第7.5天腹腔注射4.5mg/kg体重MTX为最佳造模方案,神经管畸形的发生率为31.4%。小鼠胚胎组织的DHFR活性在注射MTX4.5mg/kg体重48小时后降到最低,12小时以后开始恢复,但是仍然低于注射前。小鼠全胚胎连续切片HE染色结果显示,神经管畸形多数表现为神经管后脑未闭合畸形,少数表现为神经管全脑未闭合畸形,颅脊柱裂等。2、与正常胚胎相比,NTDs小鼠胚胎gDNA缺失的片段共12个。主要在7号、9号、11号以及X染色体。缺失长度从5Kb-18Mb不等;扩增的片段共9个,均位于6号染色体,长度在3Kb-5Kb不等。进行高可信度标准筛选后,3个CNV被认为是高可信度CNV,且这3个CNV均位于X染色体,对这3个CNV进行验证以后证实这3个片段拷贝数缺失。GO结果显示位于这3个CNVs上所有的103个基因中,参与细胞代谢过程的基因数量最多,有25个。参与其他生物学过程还包括:物质转运、信号转导、细胞凋亡、细胞周期等等。3、与正常胚胎相比,3个NTDs小鼠胚胎共同发生低甲基化的区域有35个,3个NTDs小鼠胚胎共同发生高甲基化的区域有97个,进行高可信度筛选以后,26个区域被认为具有高可信度,惊奇地是,这26个区域均位于X染色体,并且在NTDs小鼠胚胎都为低甲基化。这些区域大多数位于基因的启动子区（promoter）,少数位于基因内（within）,或者基因的上下游（left、right）,基因注释后结果显示,这些区域影响到的基因共30个,其中3个基因是同时发生了CNV缺失和低甲基化,这3个基因分别为Ebp、Otud5、Maoa。4、TUNEL和pH3免疫组化结果显示:与正常对照组相比,NTD小鼠胚胎神经上皮细胞增殖减少（P<0.05）,凋亡增加（P<0.05）;与正常组相比,caspase 3在脑的表达增加（P<0.05）。结论1、本研究应用抗叶酸代谢药MTX抑制了小鼠胚胎叶酸代谢通路,成功建立了神经管畸形的小鼠模型,进一步证实了叶酸缺乏及其相关代谢障碍与神经管畸形的密切关系。2、MTX通过抑制小鼠胚胎的叶酸代谢通路,引起小鼠胚胎基因组发生拷贝数变异以及甲基化的改变,导致基因组的不稳定性,其中对X染色体的影响最大。叶酸代谢障碍所导致的基因组的不稳定性可能是神经管畸形发生的分子机制。3、神经管畸形小鼠神经上皮细胞增殖减少、凋亡增加。增殖减少可能是由于DNA/RNA合成原料减少所导致,而凋亡可能正是基因组不稳定的结果。神经管上皮增殖和凋亡的不平衡可能最终导致神经管畸形的发生。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词对照表
• 前言
• 第一章 甲氨蝶呤诱导神经管畸形小鼠模型的建立
• 1. 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验器材
• 1.3 实验试剂
• 1.4 溶液配制
• 2. 方法
• 2.1 动物实验
• 2.2 DHFR 相关代谢检测
• 2.3 组织病理检测
• 2.4 统计分析
• 3. 结果
• 3.1 MTX 致出生缺陷动物模型的建立
• 3.2 MTX 对胚胎叶酸相关代谢的影响
• 3.3 MTX 引起胚胎发育异常
• 3.4 MTX 引起胚胎神经管发育异常的病理改变
• 4. 讨论
• 第二章 微阵列比较基因组杂交技术检测MTX 诱导NTD 模型基因组拷贝数变异
• 1. 材料
• 1.1 实验试剂
• 1.2 实验器材
• 1.3 溶液配制
• 2. 方法
• 2.1 aCGH 实验方法
• 2.2 Real Time-PCR
• 2.3 MessARRAY
• 3. 结果
• 3.1 拷贝数变异结果
• 3.2 定位于变异片段上的基因分析结果
• 3.3 验证结果
• 4. 讨论
• 第三章 全基因组甲基化芯片检测MTX 诱导NTD 模型基因组甲基化的改变
• 1. 材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验试剂
• 1.3 试剂配制
• 2. 方法
• 2.1 甲基化芯片实验方法
• 2.2 RT-PCR 实验方法
• 3. 结果
• 3.1 甲基化芯片结果
• 3.2 甲基化改变区域基因分析结果
• 3.3 同时发生拷贝数变异和甲基化改变的基因
• 3.4 用RT-PRC 观察基因在mRNA 水平的表达情况
• 4. 讨论
• 第四章 MTX 引起一碳代谢紊乱对NTDs 小鼠胚胎神经上皮细胞增殖和凋亡的影响
• 1. 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验器材
• 1.3 实验试剂
• 1.4 试剂配制
• 2. 方法
• 2.1 TUNEL 检测细胞凋亡
• 2.2 免疫组化方法
• 2.3 Western blot 检测 Caspase-3 的表达
• 2.4 统计学处理
• 3. 结果
• 3.1 TUNEL 染色检测细胞凋亡
• 3.2 Phospho-Histone H3 的检测结果
• 3.3 Caspase-3 在小鼠神经组织的表达
• 4. 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢