miR-21靶向PDCD4影响神经胶质瘤细胞的凋亡

论文摘要

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。尽管在过去的20年中,外科手术、放疗以及化疗等医疗手段不断进步,但是神经胶质瘤患者的预后与生存期并未得到明显的提高。深入了解神经胶质瘤在侵袭、转移以及凋亡等过程所涉及的分子机制,阐明神经胶质瘤的发生与发展机制,是建立新的神经胶质瘤分子诊断标准、开发神经胶质瘤分子治疗技术的理论基础。微小RNA（miRNA）是一类内源性的非编码RNA,它们可以直接导致mRNA的降解,或在转录后水平调控mRNA的翻译。近来研究发现,miRNA参与了细胞中各种基本生命过程的调控,包括细胞增殖分化、能量代谢和细胞凋亡等,miRNA的异常表达与肿瘤的发生密切相关。近来研究发现,miR-21在神经胶质瘤中异常高表达,敲低其表达能够有效的激活caspase信号通路,促进胶质瘤细胞的凋亡。本研究开展了miR-21及其靶基因影响神经胶质细胞凋亡的分子机制研究。首先,我们利用miRanda,TargetScan和Pictar对miR-21的靶基因进行了生物信息学分析。随后,我们结合OMIM数据和文献阅读分析了候选靶基因与神经胶质瘤和细胞凋亡的相关性,筛选出PDCD4、MTAP、SOX5、NTF3、JAG1、RHOB、MAPK10和NFIB进行了后续的荧光素酶活性分析。结果发现,PDCD4、MTAP、SOX5的3’端非编码区（3’UTR）中可能带有miR-21的调控位点。利用miRanda软件对PDCD4、MTAP、SOX5 3’UTR中的miR-21结合位点进行分析,并在不同物种中比较了结合位点序列的保守性,随后进行了结合位点缺失的荧光素酶活性分析。结果发现PDCD4、MTAP、SOX5 3’UTR中带有miR-21结合位点,受到miR-21的调控。对神经胶质瘤细胞系和病理组织的研究发现,靶基因PDCD4蛋白表达水平与miR-21的表达呈负相关性。利用2’-O-Me-anti-miR-21敲低神经胶质瘤细胞系T98G中miR-21的表达后,PDCD4的mRNA水平未受影响,而蛋白水平则明显上调。这提示在T98G中高表达的miR-21在翻译水平阻止了PDCD4的表达。为进一步确认PDCD4 3’UTR带有的miR-21调控位点在T98G细胞系中受到miR-21的调控,我们把PDCD4 3’UTR野生型及其对应的miR-21结合位点缺失突变型装入到GFP报告载体pcDNA3.1-EGFP中,将它们转染到T98G中,观察内源性高表达的miR-21对GFP报告基因表达产生的影响。结果发现PDCD4 3’UTR中miR-21结合位点的确受到T98G中异常高表达的miR-21的调控。为进一步阐明PDCD4受miR-21调控这种作用关系在miR-21参与的神经胶质瘤抗凋亡过程中的作用,我们构建了一个凋亡检测系统,研究过表达的miR-21对PDCD4依赖的细胞凋亡过程的影响。结果发现异源过表达的miR-21不仅能够直接阻止PDCD4翻译对抗凋亡,还可能通过调控其它靶基因干扰PDCD4相关的细胞凋亡。通过以上研究,我们发现PDCD4、MTAP、SOX5 3’UTR中带有明确的可受miR-21调控的位点。在神经胶质瘤细胞和病理样本中凋亡诱导因子PDCD4蛋白水平的低表达和miR-21高表达相关。在神经胶质瘤细胞系T98G中,miR-21在转录后水平抑制了PDCD4的表达。外源过表达的miR-21能直接阻止PDCD4翻译对抗凋亡,还可能通过调控其它靶基因干扰PDCD4相关的细胞凋亡。以上工作,进一步加深了我们对神经胶质瘤细胞抗凋亡机制的了解,为阐明神经胶质瘤的发生与发展机制,建立神经胶质瘤miRNA相关的分子诊断标准,促进神经胶质瘤的分子治疗提供了科学合理的依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 不足和展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢