丹皮酚增强阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用及其机制研究

论文摘要

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率为30.3/10万,占所有癌症的13.13%,居第3位,近二十年来,死亡率增加了41.7%,约占全世界HCC死亡人数的42%。近年来,由于丙型肝炎病毒感染增加,肝癌的发病率在发达国家也有上升的趋势。目前,手术切除仍是治疗HCC的最佳手段。但是80%的患者在诊断时已属晚期,失去手术机会,而对于那些手术患者,其两年内的复发率也高达50%。化疗是肿瘤治疗的重要手段,但对肝癌的疗效尚令人失望。作为肝癌治疗最常用的药物—阿霉素（Doxorubicin,Dox）其有效率也仅为4%-10.5%,并且其毒副反应又进一步限制了其临床应用。传统中药以其高效、低毒的特点,近年来在肿瘤的防治中已引起了广泛的重视。丹皮酚（Paeonol,Pae）又称牡丹酚,是我省道地中药材毛莨科植物牡丹PaeoniaSuffruicosa Andr.根皮和萝摩科植物徐长卿Pycnostelma Paniculatum（Bunge）K.Schum干燥根或全草的主要有效成分,具有镇静催眠、解热镇痛、免疫调节及保护心脑血管等广泛的药理活性。我们在前期研究中发现,Pae对体外培养的多种肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用,体内应用有抗肿瘤作用。此外,我们也发现Pae能增强顺铂对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌细胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。本研究选用肝癌HepG2细胞株作为实验对象,观察Pae联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用,探讨其可能的作用机制,以期为肝癌的临床治疗提供新的方法。1 Pae联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用采用MTT法,分别观察了Pae和Dox单独以及Pae联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示:（1）Pae（7.81～250 mg/L）对HepG2细胞有增殖抑制作用,呈明显的剂量和时间依赖性。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析:r=0.9612,P＜0.01;IC50为64.30mg/L:（2）系列浓度Dox（0.16～2.5mg/L）对HepG2细胞有增殖抑制作用,呈剂量依赖性。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析:r=0.9231,P＜0.01:IC50为0.56 mg/L。（3）不同浓度的Pae（15.63、31.25、62.5mg/L）分别与系列浓度系列浓度Dox（0.16～2.5mg/L）联合对HepG2细胞有增殖抑制作用。采用CDI分析两药相互作用性质。结果发现,在合适的剂量下,Pae与Dox有协同作用（CDI＜1）。2 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡影响2.1 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡的TUNEL分析采用末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术（terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）观察HepG2细胞凋亡的形态学改变。典型的凋亡细胞形态特征包括核固缩、体积缩小、核染色质边集等。研究发现对照组细胞增殖旺盛,可见少许凋亡细胞;药物作用上述细胞48h后,细胞密度明显减少,凋亡细胞数明显增加,以联合用药组最显著。2.2 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡的FCM检测应用流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）检测细胞凋亡率。在DNA图谱G0/G1期前出现了一个代表细胞凋亡的亚G1峰即凋亡峰。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,药物处理48h后,其凋亡峰增加,以联合用药组最为显著,提示两药合用有协同诱导HepG2细胞凋亡作用。2.3 Pae联合Dox对人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响用Mcycle软件进行细胞周期分析。结果表明用药组都不同程度的引起可引起HepG2细胞在S期大量堆积,G0/G1期细胞比例明显下降以及G2/M期细胞比例的轻微减少。以联合用药组最为显著,这表明Pae增强Dox对S期细胞的阻滞作用。3 Pae联合Dox诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的可能分子机制采用Western Blot检测Bcl-2和Bax,采用细胞免疫组化法检测COX-2、Survivin和Caspase-3表达情况。结果表明,HepG2细胞中,Bcl-2、Bax、COX-2、Survivin和Caspase-3均有不同程度表达。药物处理后HepG2细胞COX-2、Bcl-2和Survivin和表达降低,而Bax和Caspase-3表达增加,以联合用药组最为显著。4结论本结果表明一定浓度的Pae能增强Dox对HepG2细胞株的增殖抑制与诱导凋亡作用,其作用机制可能与改变细胞周期分布,上调Bax、Caspase-3,下调Bcl-2、COX-2及Survivin表达有关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 2.实验材料
• 2.1 细胞株
• 2.2 药物与试剂
• 2.3 仪器与设备
• 2.4 常用液的配制
• 3.实验方法
• 3.1 细胞的培养与传代
• 3.2 细胞活力测定
• 3.3 体外增殖抑制实验
• 3.4 药物联合作用评价
• 3.5 TUNEL染色
• 3.6 流式细胞术检测细胞凋
• 3.7 Western-Blot法检测Bcl-2和Bax的表达
• 3.8 免疫细胞化学法检测COX-2、Survivin和Caspase-3的表达
• 3.9 数据的统计处理
• 4.结果
• 4.1 丹皮酚对HepG2细胞的增殖抑制作用
• 2的增殖抑制作用'>4.2 Pae增强Dox对人肝癌细胞株HepG₂的增殖抑制作用
• 4.3 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡影响
• 4.3.1 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡的TUNEL分析
• 4.3.2 Pae与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡的FCM检测
• 4.4 Pae联合Dox对人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响
• 4.5 Pae增强Dox诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的可能分子机制
• 4.5.1 Pae增强Dox对人肝癌细胞HepG2中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响
• 4.5.2 Pae增强Dox对人肝癌细胞HepG2中COX-2、Survivin和CaspaSe-3表达的影响
• 5.讨论
• 5.1 Pae对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用
• 5.2 Pae增强Dox对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用
• 5.3 Pae增强Dox疗效的可能机制初步分析
• 5.4 Pae诱导肿瘤细胞凋亡的可能分子机制
• 6.结论
• 6.1 丹皮酚和阿霉素单独应用对HepG2细胞的增殖有抑制作用
• 6.2 Pae能增强Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用
• 6.3 诱导细胞凋亡及改变细胞周期可能是Pae增强Dox抗肿瘤作用的机制
• 6.4 影响COX-2和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Survivin和Caspase-3）的表达可能是Pae增强Dox诱导细胞凋亡的机制
• 7.参考文献
• 附录
• 本人简历
• 在学期间的研究成果目录
• 致谢
• 综述
• 参考文献