受体蛋白质芯片技术的建立及在医药研究中的应用

论文摘要

最近几年,蛋白质芯片的研究应用获得了突破性的进展。该技术与一些重大基础研究计划,如蛋白质组学的基础研究,重大疾病的分子机制研究,生物大分子的结构、功能及相互作用,药物作用机理与创新药物研究,癌症诊断与治疗的研究等密切相关,为上述研究提供必要的信息和依据,成为这些研究的重要技术支撑,能够大大加快上述基础研究的进程。受体是一类介导细胞信号转导的功能蛋白,具有识别和结合细胞外生物分子（配体）以及介导信号转导的特性。受体的研究是药理学的基本任务之一,是从分子水平解释生命的生理和病理过程、药物的药理作用机制、药物分子的结构效应关系的重要依据。面对与日俱增的医学和药学难题,要突破研究效率的瓶颈,就必须要依赖先进的科学技术手段,受体蛋白质芯片技术的建立成为必不可少的研究课题。本研究旨在研制出具有国际先进水平的受体蛋白质芯片,为我国的医药研究提供一种有力的平台技术。研究内容包括:在大肠杆菌中重组表达雄激素受体以提供受体材料的来源,研制具有我国自主知识产权的受体芯片的设计和制备技术,以及将该技术应用到运动兴奋剂检测、临床血清活性性激素测定和药物高通量筛选方面。1雄激素受体在大肠杆菌中的表达实验从雄性大鼠前列腺提取雄激素受体mRNA,通过RT-PCR得到编码受体配基结合域的cDNA片段（888 bp）,将该片段通过T-A克隆后,插入到含有多聚组氨酸标签的表达载体pET-32a和含有谷胱甘肽转移酶融合蛋白标签的载体pGEX-4T中构建了表达质粒pET-32a-AR/BL21-TrxB和pGEX-4T-AND/BL21-TrxB,并将其转化到大肠杆菌BL21中。培养过夜的大肠杆菌长至光密度0.8-1.3,加入1 mmol/L IPTG 16oC低温诱导12 h,pET-32a-AR转化菌株得到高效表达的可溶性AR-LBD融合蛋白产物。通过对菌体裂解条件的优化,发现在使用0.2 mg/ml的溶菌酶后,再通过6个循环,每循环10 s的低功率超声破碎后可以得到完整的表达蛋白。在利用Ni-NTA凝胶亲和纯化目的蛋白的过程中,使用0.1 M的盐酸胍能够有效的暴露目的蛋白的组氨酸标签,达到亲和纯化的目的。在透析除盐及冷冻干燥后,对受体蛋白进行western blot鉴定,

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 雄激素受体蛋白在大肠杆菌中的重组表达
• 前言
• 第一节 雄激素受体的研究进展
• 第二节 受体蛋白的表达策略及雄激素受体制备方案
• 第三节 雄激素受体制备方法
• 第二章 受体蛋白芯片技术的建立
• 前言
• 第一节 蛋白质芯片基本制备技术
• 第二节 核受体蛋白芯片的制备：受体结合试验
• 第三节 膜受体蛋白芯片的制备：受体结合试验
• 第三章 蛋白质受体芯片医药中的应用
• 第一节 受体芯片在兴奋剂检测中的应用
• 第二节 蛋白质受体芯片在临床检测中的应用
• 第三节 蛋白质受体芯片在药物发现中的应用
• 综述：蛋白质芯片的研究进展
• 综合讨论与创新
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表及专利