东乡野生稻重复序列的克隆及染色体的物理定位

论文摘要

水稻基因组中DNA重复序列占了50%左右,重复序列在基因组间扩增和互渗的机理还不十分清楚。克隆和定位这些重复序列,以及对这些重复序列的分析将有助于更好地理解染色体结构特征及重复序列功能的研究。 本实验以细菌人工染色体(BAC)用于东乡野生稻基因组文库的构建,通过菌落原位杂交初步筛选得到可能含有特异重复序列的BAC阳性克隆。对其中一个BAC克隆(BAC40)作了进一步研究。将BAC克隆进一步亚克隆,点渍杂交筛选得到七个含有不同的重复序列的亚克隆,序列分析表明BAC克隆来自水稻第5号染色体的着丝粒附近,该七个重复单位在多条染色体上都有分布,与水稻基因组indica序列相关克隆的同源性达到了90%以上,且在各条染色体上存在不同的拷贝数,比较发现序列不完全相同,但不同拷贝之间同源性很高。以该BAC克隆为探针,通过荧光原位杂交(FISH)对其进行物理定位,杂交结果表现在多对染色体上呈现荧光信号,但信号强弱不一,主要集中在着丝粒附近,染色体臂内也有弥散信号。运用生物信息学的方法,对7个重复序列(B1,H1,C1,D3,D8,E4,H2)在染色体上分别进行了定位,并将其与前人已报道的重复序列进行比较表明相同或相似的重复序列未见报道。同时对其以及其邻近序列进行了基因预测,结果发现B1,H1为转座子蛋白编码序列的一部分,其紧密相连的序列大都为一些转座子序列,其它五个序列(C1,D3,D8,E4,H2)两侧有的为转座子相关序列,有的为蛋白编码序列。结果显示认为所克隆到的序列可能是与转座子有关的散在重复序列,该重复序列即使在同一组中变异也很迅速,因此可作为在分子水平上研究基因组进化的一个有用工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号及缩略说明
• 第一节 文献综述
• 1 重复序列的特征与分类
• 1.1 重复序列的特征
• 1.2 重复序列的分类
• 2 重复序列的功能
• 3 水稻基因组的基本特征
• 4 水稻基因组中重复序列的研究
• 5 重复序列的克隆
• 6 DNA重复序列的应用
• 6.1 作为分子标记进行基因定位和基因克隆
• 6.2 物种的起源和进化的研究
• 6.3 染色体（组）识别及外源遗传物质检则
• 7 展望
• 第二节 东乡野生稻中的重复序列的克隆、定位及分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 野生稻BAC库的构建
• 2.2.1 野生稻基因组DNA大片段的制备
• 2.2.2 大片段与载体的连接及BAC克隆插入片段大小鉴定
• 2.3 阳性克隆的筛选
• 2.3.1 水稻基因组DNA的提取
• 2.3.2 菌落裂解及与尼龙膜的结合
• 2.3.3 在滤膜上进行菌落DNA的杂交
• 2.3.3.1 探针的标记
• 2.3.3.2 菌落原位杂交与放射自显影
• 2.3.4 点渍杂交
• 2.3.5 亚克隆库的构建
• 2.3.5.1 BAC克隆质粒中量抽提
• 2.3.5.2 载体外源片段的准备以及外源片段与载体的连接
• 2.3.5.3 DH5α感受态细胞的制备及电击转化
• 2.3.5.4 亚克隆插入片段大小鉴定
• 2.4 染色体的物理定位
• 2.4.1 根尖染色体的制片
• 2.4.2 染色体荧光原位杂交
• 2.5 亚克隆的杂交筛选
• 2.6 阳性亚克隆的测序
• 3 结果与分析
• 3.1 东乡野生稻BAC库构建及插入片段大小的鉴定
• 3.2 重复序列的克隆
• 3.3 重复序列的特征及分布
• 3.4 BAC40的物理定位
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录 试验所用相关试剂及溶液的配制
• 致谢