拟黑多刺蚁毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因（mAchR）及抑瘤基因（QM）的克隆与表达研究

论文摘要

拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）隶属于膜翅目（Hymenoptera）,蚁科（Formicidae）,多刺蚁属（Polyrhachis）,是典型的社会性昆虫。该种昆虫具有独特的品级分化、行为复杂、分工明确等社会性特征,是研究昆虫发育及行为调控机制方面的很好材料。本论文以拟黑多刺蚁为研究材料。研究内容主要分为两部分:第一部分是通过RT-PCR及RACE技术从拟黑多刺蚁体内克隆获得与昆虫行为相关的毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarine acetyicholine receptor,mAchR）基因的全长cDNA序列,并对其核苷酸序列和蛋白序列进行了生物信息学分析;通过实时定量RT-PCR方法对拟黑多刺蚁体内mAchR基因的mRNA表达水平进行了相对定量研究;利用原位杂交技术对不同品级脑部mAchR基因的mRNA表达水平进行了定位研究。第二部分是对与发育相关的抑瘤基因QM全长cDNA序列进行了克隆;并利用实时定量RT-PCR技术对拟黑多刺蚁体内QM基因的mRNA表达水平进行了相对定量研究;构建拟黑多刺蚁QM基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌体内进行了诱导表达。研究结果如下:1.拟黑多刺蚁mAchR基因cDNA序列全长2699 bp,包含一个长度为1800 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码599个氨基酸残基。5’端非编码区（5’-UTR）长度为189bp,3’-UTR为711 bp。编码的蛋白质分子量为67.3 kDa,等电点pI=9.11。同源性分析表明该蛋白与意大利蜜蜂mAchR的氨基酸序列相似性达76.9%,与脊椎动物mAchR各亚型相似性在45.0%-48.3%之间。生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的7个跨膜螺旋结构域及G蛋白偶联受体的标志性序列,而且一级氨基酸序列所包含的许多功能基序信息在mAchR蛋白序列中高度保守。因此,可以确定本次克隆所获得序列为拟黑多刺蚁mAchR基因的全长cDNA序列,命名为PvmAchR并上传GenBank,获得序列号为EU573239。2.采用荧光实时定量RT-PCR方法对拟黑多刺蚁不同发育阶段、不同品级整体及脑部的PvmAchR mRNA表达水平进行相对定量分析。结果表明,PvmAchR基因在所检测的各个样本内均有表达,在卵期PvmAchR mRNA的表达量较幼虫期和蛹期高,而成虫期的表达量最高。在三个品级整体比较中,工蚁的表达量最高,雌蚁和雄蚁的表达量差异不显著。在三个品级脑部比较中,雄蚁脑部的表达量最低,而工蚁脑部和雌蚁脑部的表达量差异不显著。根据PvmAchR基因在幼虫期和成虫体内mRNA表达水平的差异性推测,拟黑多刺蚁PvmAchR蛋白的主要功能可能是在调节成虫更为复杂的行为中起重要作用;由不同品级整体及脑部之间的差异表达进一步提示,PvmAchR可能与不同品级蚂蚁的行为相关。3.采用原位杂交方法对拟黑多刺蚁不同品级脑部PvmAchR基因的mRNA表达水平进行定位研究,结果发现PvmAchR mRNA在各个品级蚂蚁脑部广泛表达。除了蕈形体萼部和领部阳性反应比较弱外,其他部位均有阳性神经元胞体和神经纤维存在,并呈现不同的表达模式。根据各个品级脑部蕈形体、视叶和嗅叶的强阳性反应,推测PvmAchR可能参与视觉和嗅觉信息的获取与整合。在三个品级的不同脑区中,工蚁嗅球内具有相对较高水平的表达;雄蚁视叶内具有相对较高水平的表达。说明PvmAchR基因在不同品级蚂蚁同一脑区的差异性表达与不同品级蚂蚁在社会性群体中所担负的不同行为职责相关。4.拟黑多刺蚁QM基因cDNA序列全长827 bp,包含一个长度为660 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码219个氨基酸残基。5’-UTR为91bp,3’-UTR为77 bp。编码的蛋白质分子量为25.1 kDa,理论等电点pI=9.93。该蛋白与意大利蜜蜂QM的氨基酸序列相似性达98.2%,与脊椎动物QM蛋白序列最低相似度达77.2%。NJ法建树分析显示,亲缘关系较近的物种QM蛋白之间的进化关系较近。生物信息学分析表明,QM蛋白属于非分泌型、非糖基化蛋白,含有多个在进化上高度保守的功能位点。将拟黑多刺蚁QM基因命名为PvQM,并上传GenBank,获得序列号为EU360768。5.利用高效原核表达载体pGEX-5X-1,成功构建了拟黑多刺蚁QM基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得成功诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳显示,带有GST标签的GST/QM融合蛋白分子量为51kDa左右。目的条带分子量与预期分子量一致,而且阴性对照内没有目的蛋白的表达,说明诱导表达成功。结果分析显示该融合蛋白主要以可溶性形式表达,极少量以包涵体形式存在。QM基因的原核表达载体的构建为抗体制备奠定基础。6.采用荧光实时定量RT-PCR方法对拟黑多刺蚁不同发育阶段、不同品级整体及脑部其PvQMmRNA的表达水平进行相对定量分析。结果表明,PvQM mRNA在所有检测样本均有表达。卵期的表达量最高;在幼虫期,一龄幼虫至三龄幼虫期表达量逐渐升高,而四龄幼虫和蛹期的表达量最低;成虫的表达量比幼虫期高但是低于卵期的表达。说明PvQM蛋白可能与拟黑多刺蚁的发育密切相关。在三个品级整体及脑部之间的比较发现,PvQM mRNA在工蚁整体及脑部的表达量最高,在雌蚁和雄蚁之间的表达量差异不显著,推测工蚁体内PvQM mRNA的高水平表达可能与工蚁在社会性群体中的行为相关。本项研究首次从社会性昆虫拟黑多刺蚁中克隆获得mAchR和QM基因的全长cDNA序列,并将序列上传GenBank;实时定量及原位杂交方法分析发现,mAchR mRNA在拟黑多刺蚁各个发育阶段及成虫体内均有表达,成虫体内的高表达及不同品级脑部的差异表达,提示mAchR基因与不同品级成虫行为相关;实时定量方法分析发现,QM mRNA在拟黑多刺蚁各个发育阶段及成虫体内广泛表达,而卵期的高表达及发育阶段的差异表达提示,QM基因与拟黑多刺蚁的发育密切相关;成功构建PvQM基因的原核表达载体为后期抗体制备工作奠定基础。这些研究结果将为深入探讨昆虫mAchR及QM的具体功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 拟黑多刺蚁毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因（mAchR）的克隆与表达
• 第1章 前言
• 1.1 拟黑多刺蚁概述
• 1.1.1 拟黑多刺蚁简介
• 1.1.2 拟黑多刺蚁的品级与社会分工
• 1.1.3 拟黑多刺蚁的营养成分及应用研究
• 1.1.4 拟黑多刺蚁的脑部结构
• 1.2 毒蕈碱型乙酰胆碱受体研究概述
• 1.2.1 毒蕈碱型乙酰胆碱受体的分子结构
• 1.2.2 毒蕈碱型乙酰胆碱受体的分型及各亚型之间的关系
• 1.2.3 毒蕈碱型乙酰胆碱受体的表达与功能
• 1.2.4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体介导的信号转导途径
• 1.2.5 毒蕈碱型乙酰胆碱受体在昆虫中的研究概况
• 1.3 生物信息学在基因cDNA序列分析及蛋白功能预测中的应用
• 1.3.1 生物信息学数据库
• 1.3.2 核酸序列的生物信息学分析
• 1.3.3 蛋白质序列的生物信息学分析
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 研究内容与技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 第2章 拟黑多刺蚁mAchR基因全长cDNA序列的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器设备与主要试剂
• 2.1.3 常用溶液配方
• 2.1.4 总RNA的提取
• 2.1.5 总RNA质量鉴定与第一链cDNA合成
• 2.1.6 引物设计与合成
• 2.1.7 拟黑多刺蚁mAchR全长cDNA序列的扩增
• 2.1.8 序列拼接
• 2.1.9 开放阅读框分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 拟黑多刺蚁mAchR基因全长cDNA序列的扩增
• 2.2.3 拟黑多刺蚁mAchR cDNA序列开放阅读框分析
• 2.2.4 拟黑多刺蚁mAchR cDNA序列开放阅读框的验证
• 2.3 讨论
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 RACE技术
• 2.3.3 全长cDNA序列的判定
• 第3章 拟黑多刺蚁mAchR蛋白序列的生物信息学分析
• 3.1 方法
• 3.1.1 蛋白质基本性质分析
• 3.1.2 蛋白质功能预测
• 3.1.3 蛋白质二级结构分析
• 3.1.4 蛋白质三级结构分析
• 3.1.5 蛋白质序列之间的多重比对及分子进化分析
• 3.1.6 昆虫mAchR蛋白序列的比对分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 拟黑多刺蚁mAchR蛋白序列基本性质分析
• 3.2.2 蛋白质功能预测
• 3.2.3 蛋白质二级结构分析
• 3.2.4 蛋白质三级结构分析
• 3.2.5 系统发育分析
• 3.2.6 昆虫mAchR蛋白序列的比对分析
• 3.3 讨论
• 第4章 荧光实时定量RT-PCR技术检测拟黑多刺蚁mAchR基因mRNA水平表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂与仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 引物有效性检测
• 4.2.2 拟黑多刺蚁各个发育阶段PvmAchR mRNA的相对表达
• 4.2.3 拟黑多刺蚁不同品级脑部PvmAchR mRNA的相对表达
• 4.3 讨论
• 第5章 拟黑多刺蚁脑部PvmAchR mRNA的定位研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 原位杂交探针
• 5.1.4 常用溶液配方
• 5.1.5 原位杂交组织化学方法
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 PvmAchR mRNA在工蚁脑部的表达
• 5.2.2 PvmAchR mRNA在蚁后脑部的表达
• 5.2.3 PvmAchR mRNA在雄蚁脑部的表达
• 5.2.4 图像分析及统计结果
• 5.3 分析与讨论
• 第二部分 拟黑多刺蚁抑瘤基因（QM）的克隆与表达
• 第6章 QM基因综述
• 6.1 QM基因结构及QM蛋白的理化性质
• 6.2 QM基因的表达分布
• 6.3 QM基因的生物学功能
• 6.4 QM基因在昆虫中的研究概况
• 6.5 研究目的与意义
• 6.6 研究内容与技术路线
• 6.6.1 研究内容
• 6.6.2 技术路线
• 第7章 拟黑多刺蚁QM全长cDNA序列的克隆与序列分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 拟黑多刺蚁QM基因全长cDNA序列的扩增
• 7.1.3 序列特性及系统进化分析
• 7.2 实验结果
• 7.2.1 拟黑多刺蚁QM基因全长cDNA序列的扩增
• 7.2.2 拟黑多刺蚁QMcDNA序列开放阅读框分析
• 7.2.3 拟黑多刺蚁QMcDNA序列开放阅读框的验证
• 7.2.4 拟黑多刺蚁QM基因的生物信息学分析
• 7.3 分析与讨论
• 第8章 拟黑多刺蚁QM基因原核表达载体的构建
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 实验结果
• 8.2.1 PvQM基因ORF的扩增及双酶切鉴定
• 8.2.2 质粒pGEX-5X-1的提取与双酶切鉴定
• 8.2.3 重组质粒pGEX-5X-1/QM的PCR鉴定和双酶切鉴定
• 8.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和SDS/PAGE蛋白电泳分析
• 8.3 分析与讨论
• 第9章 实时荧光定量RT-PCR技术检测拟黑多刺蚁QM基因mRNA水平的表达
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 实验材料
• 9.1.2 实验方法
• 9.2 实验结果
• 9.2.1 引物专一性检测
• 9.2.2 拟黑多刺蚁各个发育阶段PvQM mRNA的相对表达
• 9.2.3 拟黑多刺蚁不同品级脑部PvQM mRNA的相对表达
• 9.3 分析与讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间研究成果