柑橘线粒体DNA高效提取技术体系的建立及其RAPD分析

论文摘要

线粒体是植物细胞的重要细胞器,具有相对独立的遗传物质。大量研究表明,线粒体基因组与真核细胞的抗药性、细胞的生命周期、植物的细胞质雄性不育有关。提取高质量的mtDNA是进行线粒体基因组研究的前提,也是开展植物细胞质雄性不育分子机理研究的先决条件。本研究对柑橘雄性不育品种江西无核椪柑进行了胚性愈伤组织的诱导;并以江西无核椪柑、黔阳无核、伏令夏橙等为材料建立了柑橘线粒体DNA高效提取技术体系;同时,对所提取的mtDNA进行了RAPD分析。主要研究结果如下:1、以江西无核椪柑成熟果实中的未发育胚珠为试材,采用MT、MES（MT+500mg/L ME+40 mg/L SAD）、MK（MT+0.5 mg/L KT）和MGS（MT+500 mg/L ME+1mg/L GA3+40 mg/L SAD）4种培养基进行胚性愈伤组织诱导。结果表明在不同培养基上胚性愈伤组织的发生频率不同;麦芽提取物和GA3有利于胚性愈伤组织的发生;暗培养有利于胚性愈伤组织的诱导;在继代培养基中添加5 mg/L的AgNO3有利于小而弱的胚状体基部形成胚性愈伤组织,同时能够抑制胚状体的发生。2、以7个柑橘品种的胚性愈伤组织为试材,通过差速离心分离出线粒体,蔗糖衬挚法进一步纯化,建立了柑橘线粒体DNA（mtDNA）的快速提取体系。提取的线粒体完整,具有很强的荧光活性。线粒体样经SDS、蛋白酶K、核酸酶处理后用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇处理、乙醇沉淀,得到线粒体DNA（mtDNA）,对提取的mtDNA进行紫外分光光度计分析,A260/A280平均为1.80,A260/A230平均为1.95。0.7%琼脂糖电泳获得清晰、整齐的条带。mtDNA片段在20 kb左右,且无降解。本实验采用差速离心的方法,与通常采用的密度梯度离心法相比,耗时短,对离心机的要求不高,且所提取的mtDNA产率高,结构完整。3、从30条随机引物中共筛选出14条扩增产物带型清晰、具有较好的多态性的引物,以7个品种的mtDNA为模板进行RAPD分析。7个品种均扩增出较多的条带,呈现出较清晰的多态性,大小分布在250 bp～2000 bp之间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 植物雄性不育研究进展
• 1.2.1.1 植物雄性不育概况
• 1.2.1.2 细胞核雄性不育
• 1.2.1.3 细胞质雄性不育
• 1.2.1.4 胞质基因组的研究进展
• 1.2.1.4.1 叶绿体基因组的特点
• 1.2.1.4.2 与细胞质雄性不育相关的叶绿体基因研究
• 1.2.1.4.3 线粒体基因组的特点
• 1.2.1.4.4 与细胞质雄性不育相关的线粒体基因研究
• 1.2.2 柑橘不育性研究进展
• 1.2.2.1 柑橘无核品种的选育情况
• 1.2.2.2 柑橘雄性不育的主要类型
• 1.2.2.2.1 花粉及花粉母细胞退化
• 1.2.2.2.2 减数分裂中染色体变异
• 1.2.2.2.3 花粉粒的退化
• 1.2.2.2.4 环境影响
• 1.2.3 分子标记概述
• 1.2.3.1 分子标记的概念
• 1.2.3.2 分子标记的种类
• 1.2.3.3 分子标记在CMS研究中的应用
• 1.2.3.4 关于RAPD技术
• 1.3 本研究的目的和内容
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 胚性愈伤组织诱导材料
• 2.1.2 线粒体DNA提取材料
• 2.1.3 RAPD分析材料及引物来源
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 所需试剂及缓冲液的配制
• 2.2.2 胚性愈伤组织的诱导
• 2.2.2.1 材料的预处理
• 2.2.2.2 培养方法
• 2.2.3 线粒体DNA的提取与纯化
• 2.2.3.1 线粒体的提取和纯化
• 2.2.3.2 线粒体裂解及DNA纯化
• 2.2.3.3 线粒体活性、线粒体DNA质量及活性检测
• 2.2.4 RAPD分析及电泳检测
• 3 结果与分析
• 3.1 胚性愈伤组织的诱导
• 3.2 mtDNA提取及纯化
• 3.2.1 mtDNA提取与纯化质量
• 3.2.1.1 材料的选择
• 3.2.1.2 材料的用量
• 3.2.1.3 缓冲液成分对mtDNA提取的影响
• 3.2.1.4 裂解温度及时间对mtDNA产率的影响
• 3.2.1.5 KAC的用量对mtDNA提取结果的影响
• 3.2.1.6 影响mtDNA产率的其他因素
• 3.2.2 线粒体活性分析
• 3.2.3 紫外分光光度计分析
• 3.2.4 mtDNA的琼脂糖电泳检测结果
• 3.3 mtDNA的RAPD分析
• 3.3.1 引物的筛选
• 3.3.2 mtDNA的RAPD分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 图版和说明
• 致谢