β-分泌酶在脑淀粉样血管病变中的作用研究

论文摘要

脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy,CAA）是一种与老龄相关的脑部小血管疾病,其病理特点是β淀粉样蛋白（amyloidβ-protein,Aβ）沉积在皮层和软脑膜中小动脉管壁的中层及外层。CAA并发的原发性非外伤性颅内出血（CAA-related hemorrhage,CAAH）是老年人自发性脑出血的常见病因,但其发生机制尚不清楚,也缺乏有效的防治手段。β-分泌酶（β-site of APP-cleavingenzyme,BACE1）是酶切淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）,生成Aβ的关键酶。散发性阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病人脑内BACE1的蛋白表达和活性水平明显升高,表明BACE1在淀粉样病变的发病机制中发挥重要作用。本研究首先采用人软脑膜和大脑皮层样本,以及不同的血管细胞株明确BACE1在脑血管壁上是否能表达及其确切的表达部位。然后采用快速尸检、病理明确诊断的CAA病变的人软脑膜血管样本,定量测定BACE1的蛋白表达和酶活性水平,同时以紧密连接（tight junctions,TJs）蛋白作为血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的评价指标,定量测定TJs的蛋白表达水平。最后,通过CAA的转基因动物模型——APP23小鼠和细胞模型——脑微血管内皮细胞株（bEnd.3）,探索BACE1在CAAH发病机制中的作用,以期为CAA和CAAH的防治提供新途径。第一部分BACE1在脑血管壁上的表达目的:BACE1在脑内主要表达于神经元。为了研究BACE1在CAA中的作用,首先需要明确BACE1在脑血管壁上是否能表达及其确切的表达部位。方法:采用快速尸检的正常老年人软脑膜血管和大脑皮层血管样本、人主动脉平滑肌细胞、人脐静脉内皮细胞以及脑微血管内皮细胞株（bEnd.3）等不同的组织和细胞,运用Western-blot、免疫组织化学和免疫细胞化学的方法,采用不同的BACE1抗体,检测BACE1的表达。结果:正常老年人的软脑膜血管和皮层血管壁上能够表达BACE1,与神经元表达的BACE1蛋白分子量相同,但其表达量明显低于神经元。血管内皮细胞（脐静脉内皮细胞和脑微血管内皮细胞）和平滑肌细胞均能表达BACE1,表达部位为胞浆。结论:BACE1不仅表达于神经元,还广泛分布于脑血管内皮细胞和平滑肌细胞中。在人脑微血管壁上,尤其是脑微血管内皮细胞中检测到BACE1的表达,为进一步研究BACE1在CAA和CAAH发病机制中的作用奠定了基础。第二部分BACE1在CAA病变的脑内和脑血管壁上的蛋白表达和活性目的:作为Aβ生成的关键酶,BACE1的蛋白表达和活性水平在AD病人脑内显著升高,并且第一部分已经证实BACE1在人脑微血管壁上能够表达。此部分拟明确BACE1在在有大量Aβ沉积的脑血管壁,即CAA病变的脑内和脑血管壁上的蛋白表达和活性情况。方法:随机选取病理明确诊断的6例AD合并有中重度CAA病变的患者（AD+CAA组）、6例AD患者（AD组）和6例非AD个体（对照组,Con组）,采用其快速尸检的人大脑皮层和软脑膜血管样本,Western-blot检测BACE1的蛋白表达水平以及APP经BACE1酶切后的产物——C99片段的蛋白表达水平,测定BACE1活性水平,并且定性（免疫组织化学）和定量（ELISA）观察脑血管壁上Aβ的沉积量。结果:三组研究对象在性别、年龄、死后尸检时间方面均匹配。AD+CAA组仅1例患者发生CAA并发的脑叶出血。AD+CAA组中有1例死于突发的心血管事件,1例死于急性脑叶出血,其余死于AD并发症（脱水/恶病质,肺炎,心、肾功能衰竭）,AD组患者均死于AD并发症,对照组均死于心或肾功能衰竭。脑内,AD组和AD+CAA组BACE1的蛋白表达和活性水平均显著高于对照组,而AD组与AD+CAA组之间无明显差异;软脑膜血管壁上,AD+CAA组BACE1的蛋白表达水平显著高于AD组和对照组,而AD组和对照组之间无明显差异,AD组和AD+CAA组BACE1的活性水平显著高于对照组,而AD组和AD+CAA组之间无明显差异,C99蛋白表达水平在AD+CAA组显著高于AD组和对照组。AD+CAA组的皮层血管壁上可见大量Aβ的沉积,包括Aβ40和Aβ42,同时伴有血管平滑肌细胞和内皮细胞的破坏和数量减少。Aβ40和Aβ42ELISA定量测定的结果显示AD+CAA组软脑膜血管壁上Aβ40和Aβ42的沉积量显著高于对照组和AD组。结论:在有中重度CAA病变的软脑膜血管壁上,BACE1的蛋白表达和活性水平显著升高,而AD合并有中重度CAA与AD患者相比,脑内BACE1蛋白表达和活性水平无明显改变。软脑膜血管壁上BACE1的高表达和高活性,可能使APP酶解产生更多的Aβ,并最终形成CAA的病理改变。上述结果也间接提示脑血管壁可以原位产生Aβ,并且脑血管壁原位产生的Aβ是CAA病变中Aβ来源的重要组成部分。第三部分BACE1在CAA相关性脑出血中的作用研究目的:中枢神经系统微血管中相邻内皮细胞通过TJs相互连接,TJs也是BBB的重要组成成份,BBB的破坏可能是CAAH的重要原因之一。此部分拟明确CAA病变的脑血管壁上TJs的蛋白表达情况,并探索BACE1在其中发挥的作用。方法:采用与第二部分相同的快速尸检的人大脑皮层和软脑膜血管样本,Western-blot测定3组研究对象软脑膜血管壁上TJs蛋白（occludin和ZO-1）的表达水平,免疫荧光染色观察皮层血管壁上ZO-1的表达。采用CAA的动物模型——APP23转基因小鼠,Western-blot测定12月龄和24月龄小鼠皮层内occludin和ZO-1的蛋白表达水平,Perl氏普鲁士蓝染色观察脑血管周围微出血。最后,转染pcDNA-BACE1至脑微血管内皮细胞（bEnd.3）,观察BACE1对occludin的影响,并给予BACE1活性抑制剂明确BACE1作用的特异性。结果:AD+CAA组软脑膜血管壁上,occludin和ZO-1的蛋白表达水平显著低于AD组和对照组,AD组occludin和ZO-1的蛋白表达水平显著低于与对照组。AD+CAA组皮层血管壁上ZO-1的表达水平明显低于对照组,并伴有内皮细胞标记——vWF的表达量减少。12月龄的APP23小鼠皮层内ZO-1的蛋白表达水平较野生型（wild type,WT）小鼠显著下降,而此时occludin的蛋白表达水平无明显差异。24月龄时,APP23和WT小鼠皮层内ZO-1的蛋白表达水平均较低,并且与WT小鼠相比,occludin的蛋白表达水平在APP23小鼠皮层内表达显著下降。24月龄APP23小鼠皮层血管周围存在微出血。bEnd.3细胞株过表达BACE1,可使occludin的蛋白表达水平下降,给予BACE1活性抑制剂干预后,occludin的蛋白表达水平能较明显地恢复。结论:AD以及AD合并有中重度CAA病人的脑血管壁TJs存在不同程度的表达量降低,以后者更明显。APP23转基因小鼠是合适的CAA动物模型,从12月龄起出现TJs的破坏,最终可产生微出血。CAA病变的脑血管壁上高表达和高活性的BACE1可使TJs的表达下调,BBB破坏,可能是CAAH发生的重要原因之一,而BACE1可能是新的防治靶点。结论1.CAA病变的脑血管壁上BACE1的蛋白表达和活性水平明显升高,可能在脑血管壁原位生成Aβ的过程中发挥重要作用。2.CAA病变的脑血管壁上高表达和高活性的BACE1可使TJs的表达下调,BBB破坏,可能是CAAH发生的重要原因之一,BACE1可能是新的防治靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 BACE1在脑血管壁上的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 BACE1在CAA病变的脑内和脑血管壁上的蛋白表达和活性
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 BACE1在CAA相关性脑出血中的作用研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢