小麦WTK蛋白激酶相互作用蛋白的筛选与TaNPK基因的分子生物学特性分析

论文摘要

土壤盐渍化、干旱、高温、低温和机械损伤等非生物逆境是影响作物安全生产的重要因素,克隆、筛选与作物抗非逆境协迫相关蛋白基因,在作物抗逆机理解析及应用上有重要的理论和实际意义。蛋白激酶主要催化蛋白质的磷酸化,在植物生长发育、光信号传导、雄性不育、激素调节、病原反应和非生物胁迫等生命活动中起着重要的调控作用。小麦蛋白激酶WTK是本实验室克隆到一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在模拟植物拟南芥中过表达能够显著提高拟南芥对盐和干旱胁迫的抗性,可能在植物的抗逆反应中发挥着重要的作用,但具体的生理功能尚未确认。本研究以盐处理的小麦cDNA文库为基础,进行了WTK相互作用蛋白的筛选与鉴定,并对筛选的一个与WTK可能相作的蛋白激酶TaNPK,进行了启动子功能分析和亚细胞定位,获得了如下主要研究结果:（1）小麦蛋白激酶WTK相互作用蛋白的筛选与鉴定:以WTK cDNA为诱饵,从盐处理的小麦cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白质,共获得了300多个克隆,通过β-galactosidase筛选分析,共得到108个可能互作的阳性克隆。酵母体内的互作验证发现,一个蛋白激酶TaNPK可能与WTK存在相互作用。（2）TaNPK基因启动子的功能分析:利用染色体步移技术从小麦中获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以GUS为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下TaNPK的实时荧光定量分析结果一致。研究也发现,-1 083 -1 296 bp区段可能含有响应盐胁迫的负调控元件。（3）TaNPK的亚细胞定位分析:构建TaNPK基因的GFP融合蛋白表达载体16318hGFP-TaNPK,在PEG介导下转化拟南芥原生质体,荧光共聚焦显微镜下观察发现,TaNPK蛋白定位在细胞膜上。因此,TaNPK可能作为一种类受体蛋白激酶参与细胞的抗逆反应。小麦WTK蛋白激酶互作蛋白的筛选结果为以后探讨WTK的生物学功能奠定了基础。分析盐胁迫下启动子活性有助于认识TaNPK基因的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物参与盐胁迫的分子机制
• 1.1.1 离子平衡
• 1.1.2 渗透平衡
• 1.1.3 盐压力的损伤控制及修复
• 1.1.4 生长调控
• 1.2 植物蛋白激酶在逆境胁迫信号通路中的作用
• 1.2.1 植物蛋白激酶的最新研究进展
• 1.2.2 类受体蛋白激酶
• 1.2.3 促分裂原活化蛋白激酶
• 1.2.4 钙依赖/钙调素不依赖的蛋白激酶
• 1.2.5 核糖体S6 蛋白激酶
• 1.2.6 糖原合成酶激酶
• 1.3 酵母双杂交技术在信号通路研究中的应用
• 1.3.1 酵母双杂交系统的原理
• 1.3.2 酵母双杂交技术在信号通路研究中的应用
• 1.4 高等植物启动子概述
• 1.4.1 植物启动子结构
• 1.4.2 植物启动子的分类
• 1.4.3 植物启动子常用的克隆方法
• 1.4.4 植物启动子功能的研究方法
• 第二章 小麦WTK 蛋白激酶作用蛋白的筛选与鉴定
• 2.1 实验材料、主要试剂及仪器
• 2.1.1 植物材料与载体
• 2.1.2 试剂药品及及仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 诱饵载体的构建
• 2.2.2 酵母感受态细胞的制备
• 2.2.3 诱饵的自激活验证
• 2.2.4 共转化法筛选cDNA 文库
• 2.2.5 酵母克隆的初步鉴定
• 2.2.6 酵母质粒的提取
• 2.2.7 候选克隆DNA 片段测序及分析
• 2.2.8 本章实验用培养基配方
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 WTK 诱饵载体的构建与自激活作用的检测
• 2.3.2 小麦盐处理cDNA 文库的筛选
• 2.3.3 候选基因的测序结果分析
• 2.3.4 酵母体内验证WTK 与TaNPK 的互作
• 2.4 讨论
• 第三章 TANPK 启动子的活性分析
• 3.1 实验材料、主要试剂及仪器
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 试剂药品及仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 染色体步移法克隆TaNPK 基因的5’端侧翼序列
• 3.2.2 TaNPK 启动子的序列分析
• 3.2.3 TaNPK 启动子驱动下的GUS 基因的瞬时表达载体构建
• 3.2.4 PEG 介导下拟南芥叶片原生质体的瞬时表达
• 3.2.5 GUS 活性的定量检测
• 3.2.6 实时荧光定量PCR 检测盐胁迫下TaNPK 基因的表达水平
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 TaNPK 启动子的克隆与序列分析
• 3.3.2 TaNPK 启动子5′端不同缺失表达载体的构建
• 3.3.3 拟南芥原生质体的制备与活力鉴定
• 3.3.4 GUS 活性荧光定量检测
• 3.3.5 NaCl 处理下TaNPK 的表达水平分析
• 3.4 讨论
• 第四章 TANPK 基因的亚细胞定位
• 4.1 实验材料、主要试剂及仪器
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株及载体
• 4.1.3 试剂药品及仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 TaNPK 与GFP 融合载体的构建
• 4.2.2 TaNPK 蛋白跨膜域的预测
• 4.2.3 PEG 介导法转化拟南芥原生质体
• 4.3 结论与分析
• 4.3.1 TaNPK 与16318hGFP 融合载体的构建
• 4.3.2 TaNPK 蛋白的跨膜区预测结果
• 4.3.3 TaNPK 基因的亚细胞定位观察
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介