论文摘要
胡桃楸（Juglans mandshurica Maxim.）是珍贵的用材树种,也是重要的药源植物,具有多种生物活性,尤其是抗肿瘤活性。目前,已从胡桃楸的根、树皮、叶及青果皮中分离出了醌类、黄酮类、二芳基庚烃类、多酚类、萜类和挥发油类等多种化合物。本研究以生产胡桃楸种仁的废弃物种仁壳为原料,分离纯化胡桃楸种仁壳黄酮（flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica,FSSJM）,并对其安全性和功能活性进行了系统研究。主要研究结果如下:以总黄酮得率为响应值,采用Box-Behnken设计,响应面法优化,得到超声波辅助提取工艺条件为:超声波功率250 W,超声波时间 31 min,料液比1:31,此条件下黄酮得率为6.62 mg/g。通过检测6种大孔树脂的静态吸附与解吸性能,结合静态吸附的动态观察,筛选出HPD-600大孔树脂纯化胡桃楸种仁壳黄酮。通过动态吸附与解吸性能分析,确定一次纯化工艺条件为:吸附时间2 h,上样液pH6,上样量1/3BV,上样液黄酮浓度为1.2 mg/mL,水洗体积4BV,用2BV的90%乙醇洗脱,回收率可达81.6%,得刭胡桃楸种仁壳黄酮一次纯化物FSSJM-1,纯度由18.6%提高到37.7%。选用40%乙醇作为二次纯化的洗脱剂,回收率可达85.9%,得到胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化物FSSJM-2,纯度进一步提高到54.39%。经高效液相初步分析FSSJM-2中含有芦丁和槲皮素两种黄酮化合物成分。通过多个氧化反应体系,采用分光光度法分析FSSJM-1和FSSJM-2的体外抗氧化作用。FSSJM-1除金属离子螯合作用外,对ABTS、DPPH和羟自由基的清除能力均高于粗提总黄酮和阳性对照BHT。与Trolox和VC比较,FSSJM-2表现出较好的清除ABTS、DPPH、羟自由基的能力和显著的脂质过氧化抑制作用,呈现剂量-效应关系,并且脂质过氧化抑制作用优于VC。通过急性毒性试验、Ames试验和小鼠骨髓细胞微核试验,从体内、体外两方面研究FSSJM-2的安全性。急性毒性试验表明FSSJM-2无毒性作用（LD50>16 g/kg）。FSSJM-2不诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株TA98和TA100的回复突变;并且对小鼠骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核发生率没有显著影响,表明FSSJM-2无致突变性和遗传学毒性。通过Ames试验和MTT试验及细胞形态学观察,研究FSSJM-2的抗突变、抗肿瘤活性。FSSJM-2对诱变剂MNNG、4NQO和B（α）P、Trp-P-1诱导的TA98和TA100菌株的直接和间接回复突变均具有显著抑制作用,呈现剂量-效应关系;FSSJM-2对HepG-2、HepG-2B、N87和MDA-MB-231等4种肿瘤细胞的增殖均具有显著的抑制作用,并使细胞出现退行性形态改变,呈现剂量-效应关系。表明FSSJM-2具有显著的抗突变和抗肿瘤活性。采用MTT法、凋亡形态学观察、流式细胞术以及Westen Blot方法,研究FSSJM-2诱导肝肿瘤HepG-2细胞凋亡的机制。结果显示,FSSJM-2对HepG-2细胞增殖抑制具有一定的时间-效应关系,对正常肝细胞生长不具有显著抑制作用,表明FSSJM-2具有对正常肝细胞的低细胞毒性和对肝肿瘤细胞的选择性作用。FSSJM-2能够改变肝肿瘤HepG-2细胞的核形态,增加早期凋亡和晚期凋亡细胞比率以及增加SubG1期细胞比率,诱导了 HepG-2细胞的凋亡。能够下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax的表达,并激活caspase-3蛋白酶,从而使其诱导的HepG-2细胞凋亡通过线粒体途径得以实现。FSSJM-2在诱导HepG-2细胞凋亡的同时,阻滞HepG-2细胞在G0/G1期和G2期。表明FSSJM-2通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞实现对HepG-2细胞增殖的抑制。