应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒（WSSV）中和抗体及感染相关蛋白的研究

论文摘要

对虾白斑综合症自1992年爆发以来,以其传播速度快,致死率高的特点,对全世界各国的对虾养殖业造成了严重的威胁。引起该病的病原体——对虾白斑综合症病毒（WSSV）,在分类学上已经被鉴定为一个新的病毒家族中的新种,其结构非常复杂,对其感染宿主的分子机理的研究难以借鉴已知病毒的研究结果。而且对虾细胞系尚未成功建立,这对WSSV中和抗体的筛选及感染相关蛋白的研究带来了困难。为此,本研究应用噬菌体展示技术对WSSV的中和抗体及感染相关蛋白进行了研究。本研究以对虾淋巴原代细胞培养为基础,建立了一种高通量体外筛选中和抗体的方法。应用该方法对本实验室已获得的抗WSSV的单链抗体进行筛选,得到了一个能够阻止WSSV与对虾淋巴原代培养细胞结合的单链抗体P1D3。活体中和实验也证实该单链抗体具有一定的中和作用。由于单链抗体是在大肠杆菌中表达和制备的,能够低成本,快速地进行无限扩增,因此该单链抗体有望发展成一种具有抗病毒能力的对虾饲料添加剂。为了完善上述已建的立体外筛选中和抗体的方法,本实验还建立了一种新的荧光定量PCR方法,对WSSV病毒粒子进行定量分析,并将该方法应用到体外筛选中和抗体的方法中。实验证明纯化的WSSV病毒悬液不需要提取DNA而可以直接作为FQ-PCR的模板进行扩增,并且能准确测定模板DNA的拷贝数,从而使该体外中和抗体筛选方法操作更为方便,也更为准确。为研究单链抗体P1D3对应于WSSV上的抗原模拟表位,本研究以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并用一种已知抗原的能与WSSV特异性结合的单链抗体A1对噬菌体展示随机肽库进行淘选,得到了一系列的阳性多肽序列。根据这些阳性多肽的氨基酸序列相似性比对分析,对单链抗体A1的抗原模拟表位做出了预测。随后对单链抗体P1D3也进行了相同的研究,得到了大量的阳性多肽序列,但是尚未成功得到P1D3的抗原模拟表位,这部分研究工作有待进一步深入。本研究还优化了对活体对虾进行体内淘选和器官体外淘选的方法,并对T7噬菌体展示的WSSV cDNA文库进行了淘选,以期获得能与对虾相关器官上的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 第一节 噬菌体展示技术概述
• 第二节 对虾白斑综合症病毒（WSSV） 研究进展
• 第三节 本研究的目的和内容
• 第二章 用噬菌体展示技术和体外筛选方法筛选抗WSSV 中和抗体
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 以荧光定量PCR 方法为基础建立的一种新的体外筛选中和WSSV 抗体的方法
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 噬菌体展示随机十肽库的构建及单链抗体抗原模拟表位的淘选和鉴定
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第五章 用体外器官淘选和体内淘选方法淘选WSSV 感染相关蛋白
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 攻读博士学位期间完成的学术论文和申请的专利
• 附录2 缩略词（ABBREVIATION）
• 致谢