稻瘟病菌一假定阿魏酸酯酶的生化性质与分子遗传研究

论文摘要

植物细胞壁是微生物病原菌与寄主植物之间的关键屏障,微生物病原菌分泌一系列细胞壁隆解酶（Cell-wall degrading enzymes,CWDEs）以解聚初生细胞壁的非纤维素多糖,从而促进其在寄主组织中的定殖。为进一步了解细胞壁降解酶在致病过程中的作用,本文初步分析了稻瘟病菌中一假定阿魏酸酯酶的生化性质与分子遗传功能。多序列比对结果显示,稻瘟病菌MGG01403.5基因编码的蛋白与绳状青霉菌（Penicillium funiculosum）的阿魏酸酯酶A（Ec 3.1.1.73）具有较高同源性,故命名为MgFAEA（（?）grisea（?）erulic（?）cid（?）sterase（?））。它们都含有一个保守的细菌聚羟基丁酸酯解聚酶结构域。Signal3.0,TMHMM2.0和ProtComp6.1软件预测结果显示,MgFAEA包含一个分泌信号肽,无跨膜结构域,并且主要定位于胞外。MgFAEA-HIS6融合蛋白质的表达分析证实了MgFAEA是一个分泌蛋白.经FESM（（?）eruloyl（?）sterase（?）creening（?）edium）平板检测,MgFAEA过量表达转化子显示了更强的阿魏酸酯酶活性。RT-PCR分析结果显示,MgFAEA在稻瘟病菌无性发育阶段组成型表达,但在侵染阶段,直到后期（168hpi）,表达量才得以显著提高。MgFAEA过量表达转化子和基因敲除突变体在致病性上与野生型相比均无明显差异。FESM平板筛选显示,△mgfaeA突变体的阿魏酸酯酶活性较野生型无显著变化,这意味着稻瘟病菌的阿魏酸酯酶可能存在冗余效应。为此,通过BLASTP从稻瘟基因组数据库中搜索到三个与MgFAEA具有较高同源性的基因。运用RT-PCR分析它们在野生型与突变体中表达模式的变化,其中MGG10040.5在水稻侵染阶段的表达量,随MgFAEA基因的失活而显著提高,暗示其可能对MgFAEA具有功能互补性。本研究结果为进一步确定阿魏酸酯酶在真菌病理学中生化性质和相关功能提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物病原物产生的降解酶及作用
• 1.1.1 作为病原物侵染的致病因子
• 1.1.2 作为植物抗病反应的诱导因子
• 1.2 微生物的阿魏酸酯酶及应用
• 1.2.1 阿魏酸酯酶的种类与催化专一性
• 1.2.2 阿魏酸酯酶的基因表达与调控
• 1.2.3 阿魏酸酯酶的应用现状
• 1.3 稻瘟病菌阿魏酸酯酶的研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试质粒
• 2.1.3 供试植物
• 2.1.4 生化试剂
• 2.1.5 常用培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 2.2.2 DNA琼脂糖电泳
• 2.2.3 稻瘟病菌菌丝体、孢子、芽管及侵染后水稻叶片的获得
• 2.2.4 总RNA的提取与分析
• 2.2.5 RT-PCR
• 2.2.6 PCR
• 2.2.7 质粒酶切与连接
• 2.2.8 Escherichia.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.9 感受态细胞的转化
• 2.2.10 质粒DNA的提取
• 01403.5（mgfaeA）敲除突变体的构建'>2.2.11 mgg₀1403.5（mgfaeA）敲除突变体的构建
• 2.2.12 分泌蛋白的提取及纯化
• 2.2.13 SDS-PAGE电泳
• 2.2.14 阿魏酸酯酶平板筛选法
• 2.2.15 水稻致病性的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 稻瘟病菌假定阿魏酸酯酶基因的分析
• 3.2 MgFAEA过量表达突变体的构建及目标蛋白的检测
• 3.3 MgFAEA过量表达突变体生化性质的初步研究
• 3.4 MgFAEA过量表达转化子的表型分析
• 3.5 MgFAEA基因在稻瘟病菌不同生长发育阶段的基因表达模式
• 3.6 MgFAEA基因敲除载体的构建及敲除转化子的筛选
• 3.7 ⊿mgfaeA敲除突变体的表型分析
• 3.8 MgFEAE及其同源基因在野生型与突变体中表达情况的分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢