论文题目: 杀虫剂吡虫啉的微生物转化研究——微生物转化法制备杀虫剂吡虫啉衍生物及活性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 戴亦军
导师: 袁生
关键词: 吡虫啉,微生物转化,羟基化,羟基吡虫啉,烯式吡虫啉,生物活性,嗜麦芽糖寡养单胞菌
文献来源: 南京师范大学
发表年度: 2005
论文摘要: 生物催化和转化技术因其高效性、多样性、底物专一性、区域选择性、化学选择性、对映选择性以及温和的反应条件等特点，被誉为继医药生物技术和农业生物技术之后的“第三次生物技术浪潮”。本文采用微生物转化技术进行新农药的创制。选择了高效，对温血动物低毒的烟碱类杀虫剂吡虫啉(imidacloprid，IMI)为底物，从自然界和菌种库中筛选可转化IMI的菌株，采用静息细胞转化法羟基化IMI，获得了一种IMI羟基化的转化产物5-羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI)，5-hydroxy IMI经酸、热水解可得到文献报道的杀虫活性提高10-16倍的烯式吡虫啉(olefin IMI)。 以IMI为唯一氮源进行富集培养，从土壤中筛选到了7株可将IMI转化为一种极性更大的化合物的菌株。其中一株命名为NJ1的菌株具有较高的转化IMI的能力，转化样品经HPLC／MS分析，证明该极性更大的转化产物为IMI的羟基化衍生物。采用BioMerieux Vitek自动微生物分析仪鉴定，NJ1菌株被鉴定为Stenotrophomonas maltophilia；16S rDNA结果分析进一步证明了NJ1菌株与在系统发育地位上属于S．maltophilia。从菌种库中筛选结果表明，与NJ1菌株属于同一个种的S．maltophilia CGMCC 1.1788菌株的转化能力高于NJ1菌株。S．maltophilia CGMCC1.1788被选为进一步研究用菌种。 S．maltophilia CGMCC 1.1788菌株发酵条件研究结果表明，培养温度介于20至35℃之间，羟基化酶活性几乎没有变化，而最适生长温度为30℃；最高羟基化酶活性出现在对数生长期中期之后；苹果酸和麦芽糖为最适生长碳源，琥珀酸和乙酸钠为羟基化酶活性碳源，乙酸钠为最适比酶活力碳源；牛肉膏为最适生长氮源，酵母膏和玉米浆分别为最适羟基化酶活性和比酶活力氮源；各种吡啶类化合物和咪唑烷类化合物作为诱导剂添加到培养基中，测试结果表明酶形成不需要诱导剂诱导。 5-hydroxy IMI合成条件研究结果表明，酶活性受通气量影响较大，摇瓶装液量越少，酶活性越大，摇瓶转速越高，转化活力越高；最适转化温度为25℃；在转化液中添加蔗糖、葡萄糖和苹果酸等促进剂可显著提高酶活性，添加5％(w／v)蔗糖的转活性较对照组提高了近9倍；最适羟基化酶活性pH为6.5；底物最适浓度为0.01％。
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目录
缩写
中文摘要
ABSTRACT
第一章 前言
一、先导化合物发现
1、先导化合物
2、类同合成法
二、含氮杂环农药—吡虫啉
1、吡虫啉的理化性质
2、吡虫啉的作用机制和特点
3、吡虫啉的抗性
三、吡虫啉代谢研究进展
1、IMI的代谢途径
2、IMI代谢物(metabolite)的毒性
3、IMI代谢机理研究
4、羟基吡虫啉(hydroxy IMI)和烯式吡虫啉(olefin IMI)的制备
四、生物转化技术
(一) 生物转化技术的应用
(二) 推动生物转化技术发展的关键技术
(三) 微生物转化技术
五、羟基化反应
1、羟基化反应机理
2、电子传递链
六、研究思路和方法
1、研究思路
2、研究方法设计
3、实验涉及的化合物的结构表征方法
第二章 转化吡虫啉菌种的筛选和鉴定
1.材料与方法
1.1 培养基
1.2 菌种
1.3 静息细胞的制备和转化
1.4 HPLC和LC／MS分析
1.5 生理生化反应鉴定
1.6 16S rDNA序列分析
1.7 数据统计
2.结果
2.1 从土壤中分离和筛选可转化IMI的菌种
2.2 LC／MS分析
2.3 NJ1和NJ2菌种鉴定
2.4 从菌种库中筛选可转化IMI的菌种
2.5 NJ1,NJ2和S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株转化能力比较
3.讨论
本章小结
第三章 转化产物的提纯和结构鉴定
第一节 发酵罐发酵、转化及产物提纯
1.材料和方法
1.1 培养基
1.2 菌种
1.3 培养和转化方法
1.4 HPLC分析
1.5 转化液的预处理
1.6 转化产物提取与提纯
2.结果
2.1 发酵和转化
2.2 转化液的预处理
2.3 未转化底物的去除
2.4 产物的提取
2.5 产物的纯化
3.讨论
第二节 转化产物的结构表征
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 MS分析
1.3 元素分析
1.4 紫外光谱分析
1.5 核磁共振光谱分析
1.6 单晶x-射线衍射分析
2.结果
2.1 MS分析
2.2 元素分析
2.3 紫外光谱分析
2.4 核磁共振光谱分析
2.5 单晶x-射线衍射光谱分析
3.讨论
第三节 IMI和5-HYDROXY IMI的HPLC分析研究
1.材料和方法
1.1 仪器与试剂
1.2 色谱柱和流动相
1.3 标准溶液的配制
1.4 培养和转化
2.实验结果
2.1 HPLC条件优化
2.2 标准校正曲线的线性回归方程
2.3 重现性和回收率试验
3.讨论
本章小结
第四章 发酵条件研究
1.材料与方法
1.1 菌种
1.2 培养基
1.3 培养和转化方法
1.4 生物量的测定
1.5 HPLC分析
1.6 数据统计分析
2.实验结果
2.1 不同细胞生长时期对酶形成的影响
2.2 不同碳源对酶形成的影响
2.3 不同氮源对酶形成的影响
2.4 不同培养温度对酶形成的影响
2.5 不同诱导剂对酶形成的影响
3.讨论
第五章 5-HYDROXY IMI合成条件研究
1.材料与方法
1.1 菌种
1.2 培养基
1.3 静息细胞的制备
1.4 转化反应
1.5 蛋白提取和含量测定
1.6 HPLC分析
1.7 数据统计分析
2.实验结果
2.1 不同初始pH值和不同磷酸盐缓冲液对羟基化酶活性的影响
2.2 不同转化温度对羟基化酶活性的影响
2.3 不同底物浓度对羟基化酶活性的影响
2.4 不同效应剂对羟基化酶活性的影响
2.5 摇瓶装液量对羟基化酶活性的影响
2.6 不同摇瓶转速对羟基化酶活性的影响
2.7 不同转化菌量对羟基化酶活性的影响
2.8 铵盐对羟基化酶活性的影响
2.9 转化动力学分析
2.10 转化底物特异性的研究
2.11 转化条件的综合优化
3.讨论
第六章 OLEFIN IMI的制备与生物活性测试
第一节 5-HYDROXY IMI酸热处理产物的结构鉴定
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 5-hydroxy IMI酸水解产物的制备
1.3 HPLC和LC／MS分析
1.4 紫外光谱分析
1.5 核磁共振光谱分析
2.实验结果和讨论
2.1 HPLC分析
2.2 质谱分析
2.3 紫外光谱分析
2.4 核磁共振光谱分析
第二节 5-HYDROXY IMI生成OLEFIN IMI的优化研究
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 olefin IMI标准工作曲线的制定
1.3 不同处理条件对olefin IMI生成的影响
2.实验结果与讨论
2.1 标准工作曲线的制定
2.2 不同浓度盐酸对生成olefin IMI的影响
2.3 不同温度对生成olefin IMI的影响
2.4 不同酸对生成olefin IMI的影响
2.5 不同起始浓度5-hydroxy IMI对生成olefin IMI的影响
2.6 olefin IMI稳定性
第三节 OLEFIN IMI的生物活性测定
1 材料与方法
1.1 供试样品
1.2 供试生物
1.3 综合毒力测试方法
1.4 口器摄取测试法测定olefin IMI毒力
1.5 olefin IMI的盆栽试验
2.实验结果与讨论
2.1 综合毒力测试
2.2 olefin IMI的相对毒力测定
2.3 盆栽试验
本章小结
总结
参考文献
致谢
附件
附件一：在读博士期间主要科研情况
附件二：NJ1菌株16S RDNA序列
附件三：论文查新报告主要内容
附件四：质谱分析报告
附件五：5-HYDROXY IMI元素分析报告
附件六：OLEFIN IMI和IMI对蚜虫及飞虱的活性比较试验报告
附件七：OLEFIN IMI防治蚕豆蚜盆栽试验报告
发布时间: 2006-10-27
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