茨城病病毒S7基因的克隆表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

茨城病（ibaraki disease）是由茨城病病毒引起的牛急性、热性、病毒性传染病。该病毒是呼肠孤病毒科、环状病毒属成员。该病在东南亚、澳大利亚及美洲一些国家广泛流行,我国在《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫名录》中将其列为二类传染病。目前,国内外对本病的诊断方法主要采用中和试验、补体结合试验和琼脂扩散试验等方法。本研究采用RT-PCR技术扩增得到了全长的茨城病病毒No.2株的S7基因,将其分别克隆入pET-28a（+）原核表达载体和pFasBactHTa转座载体中;同时,使用生物学软件对S7基因的编码蛋白进行了抗原性、疏水性预测,选择其中抗原性、亲水性较强片段进行亚克隆,并连接入pET-32a（+）原核表达载体中。将阳性重组原核表达质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,并进行诱导表达。同时,用阳性重组转座载体转化含有穿梭载体（Bacmid）的感受态细胞DH10Bac中,经筛选获得重组穿梭载体。用携带全长S7基因的重组穿梭载体转染草地夜蛾卵巢细胞（Sf9细胞）,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达重组VP7蛋白。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析,重组蛋白在真、原核两种表达系统中都获得了表达。对表达条件进行优化,以获得最佳表达状态和最大表达量,并用Ni2+螯合亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。用原核表达的重组茨城病病毒VP7蛋白作为抗原初步建立间接ELISA方法,结果表明原核表达截短VP7更适于用作ELISA作包被抗原。以截短VP7蛋白为抗原建立间接ELISA方法,对抗原包被条件、封闭条件、抗原包被浓度、一抗浓度、二抗浓度和洗涤条件进行了优化。用建立的方法对几种常见的牛病阳性血清进行检测,检测结果证明该间接ELISA方法能有效地将茨城病阳性血清与口蹄疫、病毒性腹泻、传染性鼻气管炎和牛结核病阳性血清区分开。应用建立的ELISA方法对来自内蒙古地区的95份现地血清样品进行检测,与血清中和试验结果相比较,符合率为81%。对来自云南的70份血清样品进行检测,再次证明了我国的确存在茨城病抗体阳性牛。两处现地血清的检出阳性率符合茨城病的流行病学特征,说明本方法可初步用于茨城病特异性抗体的检测。本研究克隆了茨城病病毒No.2株的S7基因,并利用大肠杆菌表达系统或杆状病毒表达系统成功表达了全长或截短的茨城病病毒VP7蛋白。用纯化后的重组VP7蛋白作为抗原初步建立了茨城病间接ELISA诊断方法,并初步运用该方法对现地血清进行了检测。实验证明该间接ELISA方法可以快速、有效地检测牛只茨城病的感染状况,将为我国茨城病的检测和血清流行病学调查提供更加快速、有效的技术手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 病原
• 1.1.1 茨城病病毒的形态和理化特性
• 1.1.2 茨城病病毒分子结构
• 1.1.3 茨城病病毒的基因组
• 1.1.4 茨城病病毒的蛋白
• 1.1.5 茨城病病毒的复制
• 1.2 茨城病的临床症状
• 1.3 茨城病的流行病学
• 1.4 茨城病的诊断
• 1.4.1 病理学诊断
• 1.4.2 病毒的分离
• 1.4.3 血清学诊断
• 1.4.4 分子生物学诊断
• 1.5 茨城病的防治
• 1.5.1 预防
• 1.5.2 治疗
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒和细胞
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液及培养基的配置方法
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 引物设计
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒的增殖及基因组RNA 的提取
• 2.2.2 目的基因的扩增及纯化
• 2.2.3 扩增基因的连接与转化
• 2.2.4 重组质粒的提取与鉴定
• 2.2.5 全长/截短VP7 蛋白的原核表达
• 2.2.6 全长VP7 蛋白的真核表达
• 2.2.7 表达的重组VP7 蛋白的鉴定
• 2.2.8 用表达的重组VP7 蛋白建立间接ELISA 方法
• 2.2.9 茨城病特异抗体间接ELISA 检测方法的初步应用
• 3 结果
• 3.1 IBAV NO.2 株 S7 基因的扩增及PMDS7 质粒的鉴定
• 3.2 S7 基因序列比较及分析
• 3.3 重组原核表达载体和重组转座载体的鉴定
• 3.4 重组杆状病毒的产生
• 3.5 表达重组蛋白的鉴定和分析
• 3.6 间接ELISA 方法的建立
• 3.6.1 ELISA 工作条件的优化
• 3.6.2 特异性试验
• 3.6.3 与中和试验的对比结果
• 3.7 茨城病特异抗体间接ELISA 检测方法的初步应用
• 4 讨论
• 4.1 重组蛋白的表达
• 4.2 重组蛋白的纯化
• 4.3 茨城病特异抗体间接ELISA 检测方法的建立
• 4.4 茨城病特异抗体间接ELISA 检测方法的初步应用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文