山东省六种植原体病害的分子检测及鉴定

论文摘要

植原体病害是世界性病害。目前,世界上已报道的植原体病害有1000多种,而我国仅报道了100多种。有许多植原体病害还有待于去研究。本论文利用分子生物学技术对发生在山东的六种植原体病害进行了检测及鉴定,主要结果如下:玫瑰丛枝病主要引起丛枝、顶枯和叶片畸形等症状,可以通过嫁接传染。电镜下在玫瑰韧皮部观察到了植原体细胞。以上结果表明玫瑰丛枝病是由植原体引起的。通过分析16S rRNA基因、tuf基因和rp基因序列发现,玫瑰丛枝植原体与泡桐丛枝植原体都属翠菊黄化植原体（Candidatus Phytoplasma asteris,16SrI组）的16SrI-D亚组,玫瑰丛枝病株病原可能是从与其仅相隔数米的泡桐丛枝病株上传播过去的。本研究首次报道了引起我国玫瑰丛枝病植原体的分子特性,并证明该植原体与国外报道的植原体（16SrI-B亚组）属于不同的亚组。从表现黄化、丛枝、顶枯等症状的绣线菊植株中DNA中扩增到了约1.2kb的片段,测序结果证明其病原为植原体。RFLP和序列分析表明,引起绣线菊丛枝病的植原体属于翠菊黄化组的16SrI-B亚组。与GenBank中其它植原体分离物序列比较,发现该分离物与16SrI-B亚组中的西方翠菊黄化植原体（SAY）同源性高达99.6%。从山东招远和泰安市分别采集到了表现丛枝症状的榆树枝条,克隆了其16S rRNA基因,并进行序列比对和RFLP分析。结果表明,自然表现丛枝症状的榆树枝条中存在翠菊黄化组的植原体。用植原体16S rRNA基因的通用引物,通过巢式PCR的方法从樱桃花变叶、国槐带化及石榴带化病株的总DNA中扩增得到了长度约1.2kb片段。序列分析表明引起樱桃花变叶的植原体可能是16SrI组的一个新亚组,引起国槐带化病株和石榴带化的植原体属于16SrI-B亚组。本研究中的樱桃花变叶、石榴带化为国内外首次报道,玫瑰丛枝、绣线菊丛枝、榆树丛枝为国内首次报道。以前国内已有关于国槐带化的报道,本研究中报道了引起这种病害植原体的分子特性。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 一 引言
• 1 植原体的一般特性
• 1.1 形态结构和生理特征
• 1.2 植原体全基因组及其染色体外DNA
• 2 植原体的分类
• 2.1 植原体分类的早期研究
• 2.2 植原体分类的发展
• 2.3 植原体分类的现状
• 2.4 翠菊黄化组植原体研究现状
• 2.4.1 翠菊黄化组植原体病害
• 2.4.2 翠菊黄化组植原体分类
• 3 植原体的检测
• 3.1 生物学检测
• 3.2 显微镜检测
• 3.3 血清学检测
• 3.4 核酸杂交检测
• 3.5 PCR 检测
• 4 植原体病害的流行
• 5 植原体致病机理研究进展
• 5.1 国内研究现状
• 5.2 国外研究现状
• 6 本研究的立题依据及目的意义
• 二 研究材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料来源
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.4 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 总DNA 提取
• 2.2 植原体16S rRNA 基因的PCR 扩增
• 2.2.1 直接PCR 扩增
• 2.2.2 巢式PCR（Nested-PCR）
• 2.3 植原体tuf 基因的PCR 扩增
• 2.4 植原体rp 基因的PCR 扩增
• 2.5 植原体PCR 产物的克隆及测序
• 2.5.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.5.2 PCR 产物回收
• 2.5.3 连接反应
• 2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.5.5 连接产物转化大肠杆菌
• 2.5.6 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.5.7 重组质粒鉴定
• 2.6 序列分析
• 2.7 电子显微镜观察实验
• 三 结果与分析
• 1 玫瑰丛枝病病原的分子鉴定
• 1.1 玫瑰丛枝病病株的症状表现
• 1.2 玫瑰丛枝植原体16S rRNA 序列、tuf 基因和rp 基因的扩增结果
• 1.3 玫瑰丛枝植原体的16S rRNA 基因序列分析
• 1.4 玫瑰丛枝植原体 rp 基因序列分析
• 1.5 玫瑰丛枝植原体 tuf 基因序列分析
• 1.6 玫瑰丛枝植原体电镜观察结果
• 2 绣线菊丛枝病病原的分子鉴定
• 2.1 绣线菊丛枝病病株症状表现
• 2.2 PCR 扩增结果
• 2.3 序列测定与RFLP 分析
• 2.4 16S rRNA 基因序列分析
• 3 樱桃花变叶病病原的分子鉴定
• 3.1 樱桃花变叶病株症状表现
• 3.2 16S rRNA 基因序列分析
• 3.3 16S rRNA 基因的RFLP 分析
• 4 榆树丛枝病病原的分子鉴定
• 4.1 榆树丛枝病株症状表现
• 4.2 16S rRNA 基因序列分析
• 4.3 16S rRNA 基因的RFLP 分析
• 4.4 榆树丛枝植原体电镜观察结果
• 5 国槐带化病病原的分子鉴定
• 5.1 国槐带化病株症状表现
• 5.2 16S rRNA 基因序列分析
• 5.3 16S rRNA 基因的RFLP 分析
• 6 石榴带化病病原的分子鉴定
• 6.1 石榴带化病株症状表现
• 6.2 16S rRNA 基因序列分析
• 6.3 16S rRNA 基因的RFLP 分析
• 四 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 关于玫瑰丛枝病
• 2.2 关于绣线菊丛枝病
• 2.3 关于樱桃花变叶病
• 2.4 关于榆树丛枝病
• 2.5 关于国槐带化病
• 2.6 关于石榴带化病
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的学术论文
• 附彩图