论文摘要
目的 本研究拟从人外周血单个核细胞中克隆全长人白细胞介素-10（hIL-10）基因,构建hIL-10高效真核表达载体,通过转染兔滑膜细胞观察其表达,探讨IL-10基因治疗类风湿关节炎（RA）的可行性。 方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,并以寡聚核苷酸引物逆转录合成cDNA。根据GeneBank中人IL-10 mRNA全长开放读框（NM 000572）,设计合成人Ih-10完整开放读框序列的PCR引物,分别引入限制性内切酶酶切位点。RT-PCR扩增目的基因hIL-10,回收纯化PCR产物,经限制性内切酶酶切和T4连接酶作用下定向克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA,构建重组真核表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10,酶切分析和DNA测序验证,确认hIL-10全长开放读框正确插入真核表达载体的多克隆位点。以复合阳离子脂质体介导,重组真核表达载体转染兔滑膜细胞。收集转染后12h、24h、48h、72h和第7d、14d的细胞培养上清液,应用酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIL-10的含量,分析重组真核表达载体的转染表达情况。应用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理,P<0.05作为差别有显著性标准。 结果 经PCR扩增获得0.54kb大小的目的基因片段,构建的真核表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10经酶切及DNA测序鉴定,证明从人外周血单个核细胞中获得了完整的hIL-10基因开放读框,序列无误,插入方向正确。转染后12h、48 h、72 h和7d的培养上清液内检测出IL-10的表达,证明重组真核表达载体可成功地转染兔滑膜细胞并表达。 结论 本研究从人外周血单个核细胞中成功克隆了hIL-10基因,构建了高表达hIL-10的真核表达载体pcDNA4-HisMaxA-hIL-10,为今后开展hIL-10基因治疗类风湿性关节炎奠定了物质基础。
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