论文摘要
研究背景胰岛素抵抗是指胰岛素效应器官或部位对正常数量的胰岛素作用不敏感的一种病理生理状态,现主要是指外周靶器官对胰岛素介导的葡萄糖代谢作用不敏感的状态,是滋生多种代谢性疾病的共同危险因素,且往往存在于疾病的早期阶段。因此,对胰岛素抵抗进行干预和治疗,对防治各种代谢性疾病特别是2型糖尿病有重要意义。肥胖（主要是腹型肥胖）是胰岛素抵抗发生、发展的重要危险因素。肥胖可以通过内分泌、脂肪细胞因子、炎性反应和细胞内在信号通路导致胰岛素抵抗。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员。PPAR具有多种生物学效应,可促进脂肪细胞分化、增强机体对胰岛素的敏感性、调节体内糖平衡、抑制炎症因子生成及炎症形成、影响肿瘤生长、对心血管产生保护效应。脂肪分解产生的游离脂肪酸和脂肪细胞因子常常参与肥胖介导的胰岛素抵抗发生。肥胖,PPAR受体以及胰岛素抵抗三者间通过各种活性因子形成了一种复杂的制约关系,其中PPAR的不同受体类型（如PPARα和PPARγ）在生物活性上的差异又在很大程度上打破或维持这种平衡。正如PPARγ单纯激动剂在改善胰岛素抵抗治疗2型糖尿病的同时也带来了脂肪增多的问题,PPARα单纯激动剂在改善血脂的情况下却难以降低血糖。因此,寻找一种能够较好维持PPARs受体激动效力的药物,可能是解决这一问题的关键。祖国医学在长期的临床实践中发现大量治疗和改善胰岛素抵抗的药物及复方,其中以中医“酸入肝”、“酸胜甘”为理论指导,拟制的酸味中药复方具有较好的改善血糖血脂且不增加体重的功效。我们前期的研究已发现,酸味中药复方的重要活性物质——熊果酸,具有与PPARα和PPARγ结合的化学特性,且有调节其下游信号通路中关键蛋白的作用。因此,我们提出熊果酸可能是通过恰当激活了PPARα和PPARγ达到上述功效的。我们将通过细胞和动物实验,利用分子生物学手段,以胰岛素抵抗重要的靶器官脂肪、肝脏和肌肉为研究重点,在体外和体内探索这一机制。研究目的确定熊果酸是否能与PPARα和PPARγ受体结合以及比较其结合率与常用PPARα和PPARγ受体激动剂非诺贝特和罗格列酮的差异。观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型PPARα/γ下游信号转导通路aP2、CAP、Perilipin、MMP-1表达变化的影响,探明其抑制脂肪分化的作用机制。观察熊果酸对自发性2型糖尿病KKAy小鼠糖、脂代谢的影响和对KKAy小鼠血清中FFA,TNF-α,脂联素含量,肝脏胰岛素抵抗相关基因PEPCK、IRS-2及GLUT2表达及磷酸化,肌肉GLUT4转运以及肝脏和肌肉组织中PPARα、PPARγ及GLUT4表达的影响,探讨熊果酸改善自发性2型糖尿病KKAy小鼠胰岛素抵抗的机制。研究方法构建PPARα,PPARγ表达质粒及PPRE的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体将阳性对照PPARα和PPARγ以及PPRE调控的荧光素酶表达质粒分别与内参质粒pRL-TK瞬时转染至HepG2细胞,加入不同浓度的熊果酸、罗格列酮、非诺贝特,检测双重荧光素酶得到相对荧光素酶活性,其活性表示干预药物对PPARα和PPARγ的激活强度。将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞,再利用高糖/高胰岛素液诱导建立3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型。以10-5mol/L熊果酸干预3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型,采用RT-PCR的方法检测aP2、CAP、Perilipin、MMP-1基因mRAN表达,Westen-blot法检测aP2、CAP、Perilipin、MMP-1蛋白的表达及Perilipin的磷酸化水平。再利用PPARα/γ阻断剂与10-5mol/L熊果酸共同干预3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型观察其对相关蛋白的影响。根据随机区组设计方法将KKAy小鼠分为5组,分别设对照组,罗格列酮组,非诺贝特组,熊果酸高剂量组和熊果酸低剂量组,并以C57小鼠作为正常对照,每组7只。干预4周后,检测各组体重、肝重、腹腔脂肪重量、空腹血糖、空腹血清胰岛素、血脂四项、葡萄糖耐量、肝糖原含量及糖异生的变化;计算肝脏指数、腹脂指数、胰岛素抵抗指数;观察各组肝组织（HE染色）病理变化。应用ELESA法检测血清中FFA、TNF-α、脂联素含量;RT-PCR方法检测PEPCK、IRS-2及GLUT2基因mRAN表达;Westen-blot法检测PEPCK、IRS-2及GLUT2表达和小鼠肌肉组织中GLUT4的转运;免疫组化法观察肝脏和肌肉组织中PPARα、PPARγ、GLUT4表达。研究结果浓度为2×10-5mol/L～2×10-7mol/L熊果酸、罗格列酮和非诺贝特可诱导PGL3-PPRE-Luc转录激活,罗格列酮和非诺贝特分别对PPARγ和PPARα表达质粒具有明显转录激活作用（P<0.01）。而熊果酸在低浓度条件下对过表达PPARγ的HepG2细胞没有明显作用,在高浓度时对PPARγ和PPARα表达质粒具有显著转录激活作用（P<0.01）,其最高激动效力分别是罗格列酮和非诺贝特的38.6%和51.6%。熊果酸干预的3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型Perilipin磷酸化表达明显降低,与胰岛素抵抗组有明显差异（P<0.01）。CAPmRNA和蛋白表达明显提高（P<0.01）。加入PPARα/γ阻断剂后对Perilipin和CAP的影响明显减弱,且有统计学意义（P<0.01）。熊果酸和罗格列酮能够不同程度改善KKAy小鼠口服葡萄糖耐量,降低胰岛素抵抗指数、增加肝糖原含量;熊果酸和非诺贝特均能降低KKAy小鼠体重、肝脏指数和腹脂指数、降低腹腔脂肪重量、改善血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平,与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。熊果酸组血清中FFA、TNF-α、脂联素含量均有变化与对照组有显著差异（P<0.01）;熊果酸对肝脏中PEPCK表达及IRS-2的磷酸化影响与对照组比较有显著差异（P<0.01）;熊果酸还可以改善肌肉组织中GLUT4的转运和提高肝脏中PPARα的表达（P<0.01）。结论（1）熊果酸在2×10-5mol/L～2×10-6mol/L浓度下在体外对PPARγ和PPARα均有一定激动作用,可能是一种PPARα/γ较弱性的双重激动剂。（2）熊果酸改善3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型脂肪分化的机制可能是通过PPARα/γ激动作用影响其下游信号转导通路,抑制Perilipin磷酸化和提高CAP的表达实现的。（3）熊果酸降低自发型糖尿病KKAy小鼠体重,调节糖、脂代谢,改善胰岛素抵抗,可能通过激活PPARα和PPARγ调节其下游信号转导通路PEPCK、CAP转录和Perilipin的磷酸化,影响FFA、TNF-α、脂联素的表达,IRS-2的磷酸化和GLUT4的转运来实现的。
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