人乳头瘤病毒的临床检测及病毒L1基因的克隆

论文摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）是造成妇女子宫颈癌（Cervical Cancer）的元凶,每年在世界范围内导致50 万女性死亡。由于缺乏经济可靠的临床检测方法,目前为止我国还没有关于HPV 流行病学的准确资料,也不知道高危型HPV 的频率分布情况。为尝试解决此问题,本研究收集了北京等地妇科门诊患者宫颈脱落细胞样本122 例及尖锐湿疣样本22 例（包含5 例宫颈湿疣）,以HPV DNA 序列为模板设计了通用引物和14 对针对HPV 不同类型的特异引物,采用SSP-PCR 方法检测样本中HPV 的感染率和病毒类型。每一检测设两个PCR 重复,同时包括HPV 阳性及阴性对照。检测结果表明,使用HPV 通用引物时样本中HPV 保守DNA 片段的平均检出率为59%,与国外的报道相似。而使用自行设计的HPV 特异引物时,妇科门诊细胞学异常样品的总感染率为95.1%,门诊随机宫颈样本中HPV 的总检出率也达到89.1%。全部尖锐湿疣中存在着高浓度的HPV6 及HPV11 病毒,检出率达100%。检测发现12 种高危型HPV 在61 例细胞学异常的宫颈样本中都有检出,其中频率最高的5 种HPV 阳性率顺序为HPV18 （83.6%） > HPV33 （53.0%） > HPV16 （39.3%） > HPV56 （24.6%） > HPV58 （23.0%）。同样,12 种HPV 高危型在55 例门诊随机宫颈样品中均有检出,频率最高的5 种HPV 排列为HPV33 （75.0%） > HPV18 （65.5%） > HPV56 （27.3%） > HPV16 （25.5%） > HPV39 （21.8%）。抽样TA 克隆及DNA 序列测定证实,12 种高危型及2 种低危HPV 的PCR 放大片段与已知类型的HPV DNA 序列完全吻合。全部序列均已存入国际基因数据库GenBank 中（序列检索号DQ003066-DQ003079）。检测发现大部分门诊宫颈细胞样本中都存在严重的HPV 混合感染现象。在细胞学异常的样本中,三种HPV 混合感染的比例达到样本总数的30%,五种及以上HPV 混合感染的比例高达13.8%。在门诊随机样本中,两种HPV 混合感染的比率占样本总检测数的30.9%,也有相当比例的三种、四种及以上HPV 感染的情况。研究中我们还克隆了HPV33 编码L1 衣壳蛋白的DNA 全长基因。本研究建立了临床检测HPV 的灵敏可靠方法,首次报道HPV 病毒在我国人群中存在很高的感染及混合感染,并显示高危HPV 类型在我国人群中的频率分布可能与国外人群有所不同。检测结果预示北京地区宫颈癌正处于高发趋势。

论文目录

• 第一章 引言
• 1.1 HPV 病毒的生物学
• 1.1.1 病毒的基本结构
• 1.1.2 病毒的生活史
• 1.1.3 病毒的类型化分
• 1.1.4 病毒造成的危害
• 1.1.5 病毒的致病机理
• 1.1.6 病毒的流行病学
• 1.2 HPV 防治面临的主要问题
• 1.3 本课题的研究目标
• 第二章 临床样本中HPV 的检测和类型检定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 样本采集
• 2.1.2 试剂、耗材及仪器
• 2.1.3 特异HPV引物设计
• 2.1.4 样本DNA 制备
• 2.1.5 SSP-PCR 检测
• 2.1.6 TA 克隆
• 2.1.7 DNA 序列测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 细胞学异常宫颈样品中HPV 检测结果
• 2.2.2 妇科门诊随机样本中HPV检测结果
• 2.2.3 尖锐湿疣样本中HPV 检测结果
• 2.2.4 TA 克隆和DNA 序列测定结果
• 第三章 HPV33衣壳蛋白L1基因的分子克隆
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 特异引物设计
• 3.1.2 SSP-PCR 扩增
• 3.1.3 TA 克隆
• 3.1.4 DNA 序列测定及分析
• 3.2 结果
• 第四章 讨论
• 4.1 宫颈癌在我国北京呈高发趋势
• 4.2 SSP-PCR 可以成为HPV 检测的可靠方法
• 4.3 关于检测技术及结果的几点讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介