表达PrP/GFP融合蛋白神经细胞系的建立及其初步感染性试验

论文摘要

传染性海绵状脑病（TSEs）也称为朊毒体病,是一种致死性神经退化性疾病,细胞的朊蛋白（PrPC）转变成朊毒体(PrPSc)是TSEs的一个基本特征。朊蛋白的结构包括二硫键、天冬酰胺糖基化位点、一个信号肽序列、一个八肽重复区、一个疏水区和一个C端的糖基磷脂酰肌醇锚定位点。研究TSEs的途径之一是利用基因缺陷型小鼠和原初细胞模型作为工具,但是随着研究的不断深入,研究者更加关注基因缺陷型细胞模型和转基因型细胞模型的利用。目前对朊毒体的生物学特性以及感染传播过程还未研究清楚,而表达PrP/GFP融合蛋白的细胞模型是进行这一研究的重要工具。为了获得该细胞系,本研究以Neuro-2a细胞为基础,利用pcDNA3.1（-）真核表达载体,携带PrP/GFP融合基因,转染至Neuro-2a细胞,经荧光和G418抗性的双重连续筛选,获得了稳定表达PrP/GFP融合蛋白的Neuro-2a细胞系。并用痒病小鼠适应毒株RML成功感染了筛选到的转基因细胞系。根据已公布的小鼠PrP基因以及pEGFP载体的GFP基因序列设计引物,分别以小鼠基因组和pEGFP质粒为模板,PCR扩增PrP1-34aa、PrP94-254aa、PrP112-254aa和GFP基因。将PCR扩增出来的基因片段分别克隆到pGEM-T载体中,获得pGEM-T-mPrP1-34aa、pGEM-T-mPrP94-254aa、pGEM-T-mPrP112-254aa和pGEM-T-GFP重组质粒,并进行测序分析。分别用XbaI和AgeI酶切pGEM-T-mPrP1-34aa、EcoRV和HindIII酶切pGEM-T-mPrP94-254aa、pGEM-T-mPrP112-254aa、AgeI和EcoRV酶切pGEM-T-GFP以及XbaI和HindIII酶切pcDNA3.1（-）质粒,电泳、切胶回收酶切片段。分别将酶切回收的mPrP1-34aa、GFP、mPrP94-254aa、pcDNA3.1（-）和mPrP1-34aa、GFP、mPrP112-254aa、pcDNA3.1（-）这四个片段共连接,同时本实验分别将GFP蛋白基因序列插入到PrP基因序列的PK酶推测切割位点附近的94和112位氨基酸之前,从而分别获得融合mPrP/GFP基因的真核表达质粒pcDNA3.1（-）-mPG94和pcDNA3.1（-）-mPG112。用脂质体Lipofectamine 2000将该质粒转染至Neuro-2a神经细胞,经G418抗性筛选、荧光显微镜检测和Western-Blotting检测后,成功获得两株稳定表达mPrP/GFP融合蛋白的Neuro-2a细胞株（命名为mPG94Neuro-2a和mPG112Neuro-2a）。用痒病小鼠适应毒株RML接种构建的细胞株,连续培养10天后,每隔两代取细胞样品进行Western-Blotting检测,接种后20天检测到耐PK酶的PrPSc,而对照N2a细胞株未检测到耐PK酶的PrPSc。这一结果证明我们构建的细胞株的痒病感染潜伏期变短且表达的带3F4位点的外源蛋白能转变成PrPSc,为朊毒体感染机理的研究提供了一个有用工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 稳定表达PRP/GFP 融合蛋白神经细胞系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒与细胞系
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 目的基因的PCR 扩增
• 1.2.2 PCR 产物序列测定及其分析
• 1.2.3 重组表达质粒pcDNA3.1（-）-mPG 的构建
• 1.2.4 利用QlAprep Miniprep 质粒小量提取试剂盒提取重组表达质粒
• 1.2.5 重组表达质粒在Neuro-2a 神经细胞中的瞬时表达
• 1.2.6 致使Neuro-2a 细胞死亡的G418 最低浓度的确定
• 1.2.7 表达PrP/GFP 融合蛋白Neuro-2a 细胞系的建立
• 2 结果
• 2.1 目的片段PCR 扩增结果
• 2.2 PCR 产物T-A 克隆质粒酶切鉴定结果
• 2.3 PCR 产物序列测定以及分析结果
• 2.4 重组表达质粒pcDNA3.1（-）-mPG 酶切鉴定结果
• 2.5 重组表达质粒在Neuro-2a 神经细胞中瞬时表达检测结果
• 2.6 致使Neuro-2a 细胞死亡的G418 最低浓度
• 2.7 表达PrP/GFP 细胞系筛选结果
• 2.7.1 单克隆细胞的荧光显微镜检测结果
• 2.7.2 表达绿色荧光蛋白神经细胞株Western-Blotting 检测结果
• 2.7.3 连续传代法鉴定细胞稳定性检测结果
• 3. 讨论
• 第二章 表达PrP/GFP 融合蛋白Neuro-2a 细胞的感染试
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病原与细胞系
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 痒病鼠脑匀浆的制备
• 1.2.2 痒病鼠脑匀浆感染细胞系
• 1.2.3 感染细胞的处理
• 1.2.4 感染细胞的鉴定
• 2 结果
• 2.1 3F4 和 1H2 抗体检测细胞样品结果
• 2.2 3F4 抗体检测细胞样品结果
• 3 讨论
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文